【摘要】：目的 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種主要浸潤(rùn)黏膜及黏膜下層的慢性非特異性炎癥性腸病，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液便和血便，并伴有多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)炎、骨質(zhì)疏松等腸外表現(xiàn)。目前，UC的發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，由于病因不清、發(fā)病機(jī)制不明確，臨床上缺乏有效的治療方法，治療難度較大，已被世界衛(wèi)生組織確定為現(xiàn)代難治病之一。進(jìn)一步明確UC的發(fā)病機(jī)制，并研制新的防治藥物已經(jīng)成為UC研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。CZLC331是一種細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物，是5型Toll-like受體(TLR5)激活劑，對(duì)TLR5-NF-κB信號(hào)通路具有激活作用。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物可以通過(guò)抗細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)結(jié)腸組織TLR家族的表達(dá)水平等機(jī)制顯著保護(hù)放射性小鼠胃腸道損傷。而目前認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞凋亡失衡是UC發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。因此，我們提出一個(gè)設(shè)想，細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TLR家族的自然免疫、抗T細(xì)胞凋亡機(jī)制預(yù)防和治療UC？本研究在成功建立小鼠UC模型的基礎(chǔ)上，觀察CZLC331對(duì)UC的治療效果，并研究其發(fā)揮治療作用的可能機(jī)制，對(duì)UC的病因及發(fā)病機(jī)制提出一系列證據(jù)，為研發(fā)一種治療UC的新型藥物打下基礎(chǔ)。 方法 采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)溶液灌腸的方法建立小鼠UC模型，以灌胃針代替?zhèn)鹘y(tǒng)灌腸工具硅膠管，并進(jìn)行相關(guān)技術(shù)改良和灌腸液劑量探索，使造模效率提高，模型穩(wěn)定性增強(qiáng)；CZLC331治療效果分析：小鼠攝食水量、便血量、皮毛光澤度等一般狀態(tài)觀察。拍照觀察小鼠結(jié)腸組織黏膜和漿膜層變化。顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織HE染色的病理改變。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的抑郁指數(shù)；CZLC331治療機(jī)制研究：小鼠結(jié)腸組織提取RNA，RT-PCR方法測(cè)定小鼠結(jié)腸TLR1-4、6-9表達(dá)情況。ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平。小鼠結(jié)腸提取蛋白，Western-blot檢測(cè)NF-κB的表達(dá)情況。 結(jié)果 成功建立了小鼠UC模型，UC小鼠均出現(xiàn)少食、少動(dòng)、體重下降、皮毛光澤度下降、腹瀉、便血等現(xiàn)象，小鼠結(jié)腸充血、水腫、炎癥、潰瘍形成，病理檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織水腫、細(xì)胞排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞缺失、潰瘍形成。造模過(guò)程中以灌胃針代替?zhèn)鹘y(tǒng)造模工具硅膠管，利用麻醉機(jī)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的麻醉方法，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)技術(shù)改進(jìn)和灌腸液劑量探索，取得較好的灌腸效果，減少灌腸過(guò)程中的溢液現(xiàn)象，使造模效率提高，模型穩(wěn)定性增強(qiáng)。 治療結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331對(duì)UC小鼠具有顯著的治療效果，治療后小鼠的一般生理狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，便血、少食少動(dòng)等現(xiàn)象有所減輕，攝食/水量、活動(dòng)性明顯增加，結(jié)腸黏膜層和漿膜層充血、水腫、潰瘍、糜爛程度明顯減輕，病理改變較模型組明顯減輕，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)比較整齊、少量杯狀細(xì)胞消失及淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸。經(jīng)CZLC331治療后， UC小鼠抑郁程度較模型組明顯減輕，但與對(duì)照組相比，仍存在抑郁表現(xiàn)：治療組的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間為64.7±10.35s，顯著低于模型組(86.7±15.96s，P 0.01)，顯著高于對(duì)照組(21±5.25s，P 0.01)。治療組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間為62.5±13.92s，顯著低于模型組(111.3±41.11s，P 0.01)，顯著高于對(duì)照組(16±8.34s，P 0.01)。治療組小鼠糖水偏愛(ài)百分比66.5±7.29%，顯著高于模型組(34.5±4.64%，P 0.01)，顯著低于對(duì)照組(77.2±7.68，P 0.01)。 3.2mg/kg CZLC331蛋白在TNBS造模后4h腹腔注射治療UC小鼠，TLR家族PCR條帶的表達(dá)量顯示與模型組相比具有明顯的差異，與對(duì)照組相比，TLR1-4、TLR9模型組表達(dá)量明顯上調(diào)(P0.05)，TLR6-8模型組表達(dá)量上調(diào)尤其顯著(P0.01)；與模型組相比，TLR1的治療組表達(dá)量明顯下調(diào)(P0.05)，TLR2-4、TLR6-9的治療組表達(dá)量下調(diào)尤其顯著(P0.01)；腹腔注射CZLC331后治療組血清抑炎因子水平多數(shù)下調(diào)：血清IL-4水平，治療組(54.29±5.83ng/ml)、對(duì)照組(53.41±7.28ng/ml)、模型組(53.71±7.72ng/ml)兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。血清IL-10水平，模型組(59.36±14.46ng/ml)與對(duì)照組(91.48±24.38ng/ml)相比明顯降低(P0.05)，治療組(54.29±5.83ng/ml)與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，但升高趨勢(shì)明顯，治療組和對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；血清促炎因子IL-6水平模型組(47.10±15.72ng/ml)和治療組(48.34±8.20ng/ml)與對(duì)照組(41.48±6.33ng/ml)相比，濃度明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05)，模型組和治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。促炎因子IL-8因選取唯一時(shí)間點(diǎn)變化不明顯，故選擇造模后12h、24h、36h、48h分別測(cè)定血清IL-8濃度變化，模型組造模12h后血清IL-8水平(42.85±6.39ng/ml)，與對(duì)照組相比(36.37±3.52ng/ml)明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05)，與模型組造模后24h(31.63±2.24ng/ml)、36h(32.03±5.12ng/ml)、48h(28.88±3.79ng/ml)比較，明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P 0.05)，治療組造模后12h(35.72±6.06ng/ml)、24h(28.38±7.57ng/ml)、36h(29.63±7.57ng/ml)、48h(29.28±4.15ng/ml)血清IL-8水平，兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，且整體水平低于模型組；血清腫瘤壞死因子水平治療組(192.50±63.85ng/ml)與對(duì)照組(173.86±29.26ng/ml)相比明顯升高，模型組(140.11±12.70ng/ml)與對(duì)照組相比明顯降低，比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05)，其治療組升高可能與CZLC331激活TLR5-TNF通路有關(guān)；Western-blot檢測(cè)小鼠結(jié)腸NF-κB表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：腹腔注射CZLC331能明顯下調(diào)UC模型組NF-κB蛋白的表達(dá)量。 結(jié)論 利用TNBS溶液灌腸方法成功建立了UC小鼠模型，利用灌胃針代替硅膠管作為灌腸器材，并進(jìn)行一系列技術(shù)改良，經(jīng)改進(jìn)后的小鼠UC造模方法，造模效率高，模型重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331對(duì)UC小鼠具有顯著的治療效果，UC小鼠一般生理狀態(tài)、結(jié)腸黏膜損傷程度，病理改變及抑郁狀態(tài)均顯著改善。TLR家族，TLR5-NF-κB-TNF-α通路，白介素4、10等促炎因子均參與UC的形成。CZLC331對(duì)UC治療效果可能與其調(diào)控TLR家族成員表達(dá)，CZLC331降低體內(nèi)促炎因子水平，升高體內(nèi)抑炎因子水平，增加腸道NF-κB蛋白表達(dá)以及對(duì)TLR-NF-κB-TNF-α通路的調(diào)控等作用密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R574.62

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本文編號(hào)：2781706