【摘要】：目的構建攜帶并穩(wěn)定表達尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),為大鼠潰瘍性結腸炎模型的基因治療提供工具;探討CDX2基因過表達對潰瘍性結腸炎大鼠模型中MUC2蛋白的作用;方法1、CDX2基因重組慢病毒載體的構建及鑒定設計CDX2引物,采用PCR擴增CDX2基因片段;通過In-Fusion技術將目的基因片段連接到線性質(zhì)粒載體中,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,進行陽性克隆篩選及基因測序。將重組載體轉(zhuǎn)染293T細胞,進行慢病毒包裝、濃縮,并用熒光法進行滴度測定。2、大鼠BMSCs的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及鑒定采用骨髓貼壁法體外分離并培養(yǎng)雄性Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,流式細胞儀(FACS)檢測細胞免疫表型。將攜帶CDX2基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,利用RT-PCR及Western blot等技術檢測干細胞中CDX2 mRNA及蛋白的表達水平。3、大鼠UC模型的誘導及分組處理采用5%2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-TNBS)/無水乙醇化學法誘導雌性大鼠潰瘍性結腸炎(UC)疾病模型;再次采用FACS檢測經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的細胞免疫表型;分別將1ml生鹽水(NS,B組)、骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs,C組)、空載慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細胞(LV-BMSCs,D組)、攜帶CDX2的慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細胞(CDX2-BMSCs,E組)經(jīng)鼠尾靜脈注射移植到UC模型大鼠體內(nèi),另外設未處理的大鼠為正常對照組(A組)。4、干預后不同組別大鼠量化評分對不同組別大鼠的急性疾病活動指數(shù)(dai)評分;取移植治療后7天的大鼠結腸組織肉眼及光鏡下(he染色)觀察其損傷變化,并對其進行結腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù)(colonmacroscopicdamageindex,cmdi)、組織損傷指數(shù)(thescoringcriteriaoftissuedamageindex,tdi)量化評分。5、制備組織冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察增強綠色熒光蛋白(egfp)的表達情況。6、檢測大鼠結腸組織sry、cdx2、muc2的表達經(jīng)pcr技術檢測大鼠結腸組織內(nèi)是否表達雄性鼠特異性的sry基因,采取rt-pcr及westernblot技術檢測不同組cdx2mrna和蛋白的表達情況;用westernblot技術檢測不同組別muc2蛋白的表達情況。結果1、pcr、dna測序及wb檢測結果表明成功構建重組ubi-cdx2-mcs-3flag-cmv-egfp慢病毒載體,測定滴度為2×108tu/ml。2、facs鑒定結果顯示,大鼠bmscs表達cd29、cd73、cd90,而不表達cd34和cd45,符合骨髓間充質(zhì)干細胞的表型,成功完成大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)。rt-pcr及westernblot結果顯示cdx2基因轉(zhuǎn)染至大鼠bmscs并能穩(wěn)定表達,成功構建攜帶cdx2基因的bmscs系統(tǒng)。3、給予5%tnbs/無水乙醇灌腸處理后,大鼠出現(xiàn)厭食、扎堆、體重下降、腹瀉等結腸炎癥狀,在第3天各實驗組dai評分較正常組明顯增高,但組間無顯著差異(f=0.39,p0.05);fscs結果提示慢病毒轉(zhuǎn)染后的細胞依然表現(xiàn)出骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫表型。4、給予不同處理的骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療后第7天,e組大鼠dai、cmdi、tdi評分明顯低于b、c、d組(p0.05),c、d兩組分別低于b組(p0.05),而c、d兩組間無明顯差異(p0.05)。5、熒光顯微鏡下觀察各組冰凍切片發(fā)現(xiàn)只有d、e兩組可見大量熒光,其他組均無熒光表達,說明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。6、sry基因的pcr定性檢測發(fā)現(xiàn)c、d、e三組在213bp處可見電泳條帶,說明雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞成功移植到大鼠體內(nèi)并歸巢到結腸組織。通過QRT-PCR和WB技術定量檢測大鼠結腸組織CDX2 mRNA、CDX2蛋白和MUC2蛋白發(fā)現(xiàn),E組較B、C、D組表達增加(P0.05),B組表達量最低,明顯低于其他各組(P0.05),C、D兩組間無差異(P0.05)。結論1、成功構建了穩(wěn)定過表達CDX2基因的雄性大鼠BMSCs并移植到雌性大鼠體內(nèi);2、采用5%TNBS/無水乙醇成功誘導出大鼠潰瘍性結腸炎模型,為進一步的實驗奠定基礎;3、首次通過慢病毒載體借助骨髓間充質(zhì)干細胞組作為運載細胞將目的基因CDX2轉(zhuǎn)染到大鼠體內(nèi)過表達,探討了該基因?qū)Υ笫骍C模型中MUC2蛋白的促表達作用;4、同時也證實了骨髓間充質(zhì)干細胞對潰瘍性結腸炎的治療作用以及CDX2基因與潰瘍性結腸炎的相關性。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R574.62;R-332

【參考文獻】

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1 張瑤;顏宏利;周海s

本文編號：2781715