【摘要】：目的構(gòu)建攜帶并穩(wěn)定表達(dá)尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),為大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的基因治療提供工具;探討CDX2基因過表達(dá)對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型中MUC2蛋白的作用;方法1、CDX2基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定設(shè)計(jì)CDX2引物,采用PCR擴(kuò)增CDX2基因片段;通過In-Fusion技術(shù)將目的基因片段連接到線性質(zhì)粒載體中,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行陽性克隆篩選及基因測序。將重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行慢病毒包裝、濃縮,并用熒光法進(jìn)行滴度測定。2、大鼠BMSCs的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及鑒定采用骨髓貼壁法體外分離并培養(yǎng)雄性Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(FACS)檢測細(xì)胞免疫表型。將攜帶CDX2基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,利用RT-PCR及Western blot等技術(shù)檢測干細(xì)胞中CDX2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。3、大鼠UC模型的誘導(dǎo)及分組處理采用5%2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-TNBS)/無水乙醇化學(xué)法誘導(dǎo)雌性大鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)疾病模型;再次采用FACS檢測經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞免疫表型;分別將1ml生鹽水(NS,B組)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs,C組)、空載慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(LV-BMSCs,D組)、攜帶CDX2的慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(CDX2-BMSCs,E組)經(jīng)鼠尾靜脈注射移植到UC模型大鼠體內(nèi),另外設(shè)未處理的大鼠為正常對照組(A組)。4、干預(yù)后不同組別大鼠量化評分對不同組別大鼠的急性疾病活動指數(shù)(dai)評分;取移植治療后7天的大鼠結(jié)腸組織肉眼及光鏡下(he染色)觀察其損傷變化,并對其進(jìn)行結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù)(colonmacroscopicdamageindex,cmdi)、組織損傷指數(shù)(thescoringcriteriaoftissuedamageindex,tdi)量化評分。5、制備組織冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白(egfp)的表達(dá)情況。6、檢測大鼠結(jié)腸組織sry、cdx2、muc2的表達(dá)經(jīng)pcr技術(shù)檢測大鼠結(jié)腸組織內(nèi)是否表達(dá)雄性鼠特異性的sry基因,采取rt-pcr及westernblot技術(shù)檢測不同組cdx2mrna和蛋白的表達(dá)情況;用westernblot技術(shù)檢測不同組別muc2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果1、pcr、dna測序及wb檢測結(jié)果表明成功構(gòu)建重組ubi-cdx2-mcs-3flag-cmv-egfp慢病毒載體,測定滴度為2×108tu/ml。2、facs鑒定結(jié)果顯示,大鼠bmscs表達(dá)cd29、cd73、cd90,而不表達(dá)cd34和cd45,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型,成功完成大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。rt-pcr及westernblot結(jié)果顯示cdx2基因轉(zhuǎn)染至大鼠bmscs并能穩(wěn)定表達(dá),成功構(gòu)建攜帶cdx2基因的bmscs系統(tǒng)。3、給予5%tnbs/無水乙醇灌腸處理后,大鼠出現(xiàn)厭食、扎堆、體重下降、腹瀉等結(jié)腸炎癥狀,在第3天各實(shí)驗(yàn)組dai評分較正常組明顯增高,但組間無顯著差異(f=0.39,p0.05);fscs結(jié)果提示慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞依然表現(xiàn)出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型。4、給予不同處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后第7天,e組大鼠dai、cmdi、tdi評分明顯低于b、c、d組(p0.05),c、d兩組分別低于b組(p0.05),而c、d兩組間無明顯差異(p0.05)。5、熒光顯微鏡下觀察各組冰凍切片發(fā)現(xiàn)只有d、e兩組可見大量熒光,其他組均無熒光表達(dá),說明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。6、sry基因的pcr定性檢測發(fā)現(xiàn)c、d、e三組在213bp處可見電泳條帶,說明雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功移植到大鼠體內(nèi)并歸巢到結(jié)腸組織。通過QRT-PCR和WB技術(shù)定量檢測大鼠結(jié)腸組織CDX2 mRNA、CDX2蛋白和MUC2蛋白發(fā)現(xiàn),E組較B、C、D組表達(dá)增加(P0.05),B組表達(dá)量最低,明顯低于其他各組(P0.05),C、D兩組間無差異(P0.05)。結(jié)論1、成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)CDX2基因的雄性大鼠BMSCs并移植到雌性大鼠體內(nèi);2、采用5%TNBS/無水乙醇成功誘導(dǎo)出大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ);3、首次通過慢病毒載體借助骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組作為運(yùn)載細(xì)胞將目的基因CDX2轉(zhuǎn)染到大鼠體內(nèi)過表達(dá),探討了該基因?qū)Υ笫骍C模型中MUC2蛋白的促表達(dá)作用;4、同時(shí)也證實(shí)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用以及CDX2基因與潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)性。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R574.62;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 張瑤;顏宏利;周海s

本文編號：2781715