【摘要】：目的 1、觀察乙型肝炎病毒（HBV）對肝癌細(xì)胞系HepG2產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答的影響。 2、了解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA識別受體（AIM2、HMGB1、DAI）對肝癌細(xì)胞系HepG2中HBV復(fù)制的影響及其可能機(jī)制。 方法 1、用HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2，分別在既定時間點提取細(xì)胞總RNA，RealtimeRT-PCR檢測天然免疫信號分子表達(dá)情況。 2、用不同濃度AIM2siRNA、HMGB1siRNA、DAIsiRNA與HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta共同轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2，southernblot檢測細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體；realtimeRT-PCR檢測DAI、HMGB1、AIM2表達(dá)情況；ELISA檢測細(xì)胞上清中HBsAg與HBeAg的表達(dá)情況；并分析對HBV復(fù)制所誘導(dǎo)的天然免疫產(chǎn)生的IFIT1、IL-6、MxA表達(dá)的影響。 3、聯(lián)合阻斷兩個DNAsensors對HBV復(fù)制及蛋白表達(dá)的影響。southernblot檢測細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體，ELISA檢測細(xì)胞上清中HBsAg與HBeAg的表達(dá)情況。 4、MTT法檢測siRNA與HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta共轉(zhuǎn)后對細(xì)胞生長的影響。 結(jié)果 1、HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta轉(zhuǎn)染HepG2后可以啟動短暫的天然免疫應(yīng)答，可以激活DAI、AIM2一過性升高。 2、下調(diào)DAI、HMGB1的表達(dá)后HBV的復(fù)制均受到抑制，同時HBsAg和HBeAg的分泌也受到明顯抑制。而AIM2表達(dá)下調(diào)后HBV復(fù)制明顯增強(qiáng)，同時HBsAg和HBeAg的分泌也增多。 3、隨著siRNA濃度的升高，AIM2對HBV蛋白分泌的促進(jìn)作用逐漸降低。而HMGB1、DAI識別蛋白則隨著siRNA濃度的升高，對HBsAg和HBeAg抑制效果越明顯。 4、DAI與TBK1同時下調(diào)后，HBV蛋白表達(dá)受到抑制，表明DAI的抑制作用起主要作用。DAI與AIM2同時下調(diào)后，也表現(xiàn)出對HBV蛋白表達(dá)的抑制。HMGB1與TBK1同時下調(diào)或HMGB1與AIM2同時下調(diào)，都表現(xiàn)出對HBV蛋白表達(dá)的抑制作用。 5、不論下調(diào)AIM2、DAI后，對HBV誘導(dǎo)的IFIT1、IL-6、MxA表達(dá)沒有影響。但是下調(diào)HMGB1后，對HBV誘導(dǎo)的IL-6有影響，對IFIT1沒有顯著影響，表明HMGB1參與了HBV誘導(dǎo)的NF-kB-IL-6信號途徑，沒有參與I型IFN信號途徑。 6、AIM2、DAI對HepG2細(xì)胞活力沒有明顯影響，而HMGB1影響HepG2活力，對細(xì)胞生長有影響。 結(jié)論 1、HBV能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答。 2、DAI和HMGB1可能通過某未知的信號通路參與了HBV復(fù)制和蛋白表達(dá)過程的調(diào)控，與I型干擾素通路無關(guān)。 3、AIM2也參與了HBV復(fù)制和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，其對HBV復(fù)制影響機(jī)制需要進(jìn)一步研究. 本研究的創(chuàng)新點及意義： 對近幾年新發(fā)現(xiàn)的胞漿內(nèi)DNA識別分子DAI、HMGB1、AIM2對HBV復(fù)制的影響進(jìn)行了初步研究，首次發(fā)現(xiàn)下調(diào)AIM2可以促進(jìn)HBV復(fù)制，下調(diào)DAI、HMGB1可以抑制HBV復(fù)制，這為進(jìn)一步研究胞質(zhì)內(nèi)DNA識別受體對HBV的影響提供了實驗基礎(chǔ)和依據(jù)，并可能為HBV治療提供新的治療靶點。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62
【圖文】：

圖1 Re a l -t i me RT - P C R 檢測 HB V1 . 3復(fù)制 型質(zhì) 粒 pH Y1 0 6+ wt a誘導(dǎo) He pG 2細(xì)胞 產(chǎn) 生 天然 免 疫 下游 基 因 表達(dá) 的 時 間依 賴 性 1. 2 中間 的 接頭 分 子 MY D 8 8、 S TI N G、 TR AF 6 表 達(dá)變 化 很小 ，另 外 AS C 未檢 測到 結(jié)果 見 圖 2。 圖2 Re a l -t i m e RT - PC R 檢測 HB V1 . 3復(fù)制 型質(zhì) 粒 pH Y1 0 6+ wt a誘導(dǎo) He pG 2細(xì)胞 產(chǎn) 生 天然 免 疫

RT - P C R 檢測 HB V1 . 3復(fù)制 型質(zhì) 粒 pH Y1 0 6+ wt a誘導(dǎo) He p生天 然免 疫 信號 通 路 中 TL R s 表達(dá) 的 時 間依 賴 性 內(nèi) 核酸 識 別 分 子 ：A I M 2 、 DA I 、 RI G- 1 均 有 一 過 高， 反 而有 下 降 的趨 勢 ，結(jié) 果 見圖 4

. Re al -t i m e RT - PC R 檢測 s i RN A 下調(diào) AI M2 后三 個 基因 表 達(dá)情 況 與 HB V 共轉(zhuǎn) 后 AI M 2 下 調(diào)效 果 M 2 si R N A（ 終濃 度 20 n M ）與 HB V 1. 3 復(fù)制 型質(zhì) G 2， 質(zhì)粒 轉(zhuǎn) 染 24 h 后， si R N A 轉(zhuǎn)染 48 h 后收 細(xì) 2 si R N A 的下 調(diào)情 況 。 可 見 AI M 2 si R N A1 干擾 共轉(zhuǎn) 后 AI M 2 反而 上 調(diào)。 結(jié) 果 見圖 6。

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1 陳至善!200052上海,熊顯華!200052上海;腎癌細(xì)胞增殖活性與預(yù)后的關(guān)系[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;1998年02期

2 張秀榮,孟如松

本文編號：2780239