【摘要】：目的： 1.建立從人足月胎盤中大量分離純化滋養(yǎng)細(xì)胞的實驗方法； 2.分離純化乙肝攜帶產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞,觀察HBV抗原和DNA在滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá),了解乙肝攜帶產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中是否存在HBV的復(fù)制； 3.以HBV重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞來源細(xì)胞株,構(gòu)建HBV感染滋養(yǎng)細(xì)胞的體外模型,以肝癌細(xì)胞作為對照,觀察模型中HBV相關(guān)核酸和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平； 4.設(shè)計構(gòu)建針對HBV SmRNA的shRNA (short hairpin RNA)表達(dá)載體,與HBV重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞,觀察不同shRNA質(zhì)粒的基因敲減效果,篩選出具有顯著干擾作用的siRNA序列。 方法： 1.收集20例正常足月妊娠胎盤,剪取50g絨毛組織,胰酶聯(lián)合DNase I消化組織,簡化的密度梯度離心法聯(lián)合反復(fù)貼壁法分離純化滋養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記法、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)檢測滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)CK-7蛋白的表達(dá),計算滋養(yǎng)細(xì)胞純度。 2.收集9例血清HBsAg. HBeAg雙陽性產(chǎn)婦胎盤,分離純化滋養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記法、LSCM技術(shù)檢測滋養(yǎng)細(xì)胞純度；微粒子酶免分析法(Microparticle enzyme immunoassay, MEIA)、熒光定量PCR (Fluorescencequantitative PCR, FQ-PCR)檢測體外培養(yǎng)24、48、72h滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表達(dá)量,確定滋養(yǎng)細(xì)胞是否感染HBV; FQ-PCR檢測感染HBV滋養(yǎng)細(xì)胞中是否表達(dá)HBV復(fù)制的指標(biāo)共價閉合壞DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA) 3.通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法,以HBV重組質(zhì)粒pcDNA3-3HBV轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞來源細(xì)胞株JEG-3、JAR和肝癌細(xì)胞HepG2; PCR檢測胞內(nèi)HBV兩種DNA分子形態(tài)rcDNA (relaxed circular DNA)和cccDNA的表達(dá),FQ-PCR檢測培養(yǎng)上清HBV DNA的滴度；RT-PCR (reverse transcription PCR)檢測HBsAg編碼mRNA的表達(dá)：細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記法、結(jié)合LSCM技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)HBsAg和HBcAg的表達(dá)；MEIA檢測培養(yǎng)上清HBsAg、HBeAg的分泌量,從DNA、RNA、蛋白質(zhì)三個層面對細(xì)胞模型進(jìn)行觀察。G418篩選培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染后JAR和JEG-3細(xì)胞進(jìn)行篩選。 4.設(shè)計構(gòu)建4種針對HBV SmRNA的shRNA表達(dá)載體,分別命名為pS-603、pS-475、pS-66、pS294,設(shè)置錯義鏈載體pS-scramble和空白載體pS-0為干擾特異性對照和空白對照。脂質(zhì)體介導(dǎo)法與HBV重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染JAR細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48、72、96h收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清。細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記結(jié)合LSCM技術(shù)、Western blotting定量檢測胞內(nèi)HBsAg的表達(dá)；MEIA定量檢測培養(yǎng)上清HBsAg的分泌量；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR (Fluorescence quantitative reverse transcription PCR, FQ-RT-PCR)檢測胞內(nèi)SmRNA表達(dá)量；FQ-PCR檢測培養(yǎng)上清HBV DNA滴度,分析比較不同shRNA的干擾效果。 結(jié)果： 1.經(jīng)胰酶、DNase I聯(lián)合消化胎盤組織,簡化的密度梯度離心法聯(lián)合反復(fù)貼壁法,每50 g胎盤組織可獲得約108、純度約85%,活力約88%的滋養(yǎng)細(xì)胞。 2.9例乙肝攜帶產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)24、48、72h,培養(yǎng)上清的HBsAg表達(dá)量(S/N值)分別為3.72±1.41、1.99±0.87和1.75±0.99,HBeAg的表達(dá)量(S/CO值)分別為2.26±1.31、0.62±0.36和0.49±0.40,提示9例血清HBsAg、HBeAg雙陽性產(chǎn)婦胎盤組織皆感染了HBV；其中,HBsAg和HBeAg 24h表達(dá)量皆高于48h、72h(p0.05)。上清HBV DNA的滴度分別為(2.39±1.87)×103 copies/mL、(1.04±0.94)×103 copies/mL和(0.78±0.68)×103 copies/mL,3個時間點之間無明顯差異。9例乙肝胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞樣本中2例樣本檢測到少量HBV cccDNA的表達(dá),分別為6.75×103 copies/mL、2.22×103 copies/mL。 3.轉(zhuǎn)染pcDNA3-3HBV的JEG-3、JAR、HepG2細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)rcDNA、cccDNA和SmRNA.培養(yǎng)上清可檢測到HBV DNA的表達(dá),JEG-3與JAR細(xì)胞上清HBV DNA的表達(dá)量無顯著性差異,HepG2培養(yǎng)上清HBV DNA滴度明顯高于2種絨癌細(xì)胞的表達(dá)(p0.05)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HBsAg和HBcAg;培養(yǎng)上清HBsAg和HBeAg的表達(dá)量比較,JEG-3與JAR細(xì)胞無顯著性差異,HepG2細(xì)胞則明顯高于2種絨癌細(xì)胞(p0.05)。經(jīng)G418篩選,轉(zhuǎn)化的JAR細(xì)胞形成持續(xù)生長的陽性克隆系,而JEG-3在篩選過程中逐漸死亡 4. shRNA與HBV重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染JAR細(xì)胞后,pS-603、pS-475、pS-66組細(xì)胞內(nèi)、培養(yǎng)上清HBsAg,胞內(nèi)SmRNA和培養(yǎng)上清HBV DNA的表達(dá)量,隨轉(zhuǎn)染后時間推移逐漸降低(P0.05)pS-294、pS-scramble和pS-0組細(xì)胞HBsAg編碼mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)、培養(yǎng)上清HBV DNA的滴度無顯著性差別,并且不隨時間推移而改變。 結(jié)論： 1.簡化的密度梯度離心法聯(lián)合反復(fù)貼壁法,可獲得大量純化的足月胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞。 2.HBV感染的胎盤中可能存在低水平的HBV復(fù)制,但滋養(yǎng)細(xì)胞中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表達(dá)可能不是HBV持續(xù)復(fù)制的結(jié)果。 3.HBV重組質(zhì)粒構(gòu)建的HBV感染滋養(yǎng)細(xì)胞體外模型中,存在HBV的復(fù)制和病毒蛋白的表達(dá)。 4.RNA干擾可抑制HBV感染滋養(yǎng)細(xì)胞體外模型中病毒蛋白的表達(dá)。4種shRN表達(dá)質(zhì)粒中,pS-603、pS-475、pS-66干擾效果明顯,而pS-294干擾效果不明顯。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R512.62

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本文編號：2778698