【摘要】： 肝部分切除后肝葉增大直至恢復(fù)原肝的質(zhì)量、慢性乙型病毒性肝炎后期的結(jié)節(jié)性肝硬化和肝癌切除術(shù)后癌的復(fù)發(fā)(可能是轉(zhuǎn)移灶)等現(xiàn)象均表明肝臟具有很強(qiáng)的再生能力,生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子啟動(dòng)和調(diào)控肝臟再生。參與肝再生的成體肝干細(xì)胞(adulthepatic stem cells,DHSC)是肝細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化和癌變等生理、病理過(guò)程中的關(guān)鍵角色。最近的研究發(fā)現(xiàn)wnt信號(hào)途徑關(guān)鍵蛋白β-catenin直接參與靶基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞間的粘附,不僅是細(xì)胞增殖和分化的強(qiáng)力調(diào)節(jié)因子,而且促進(jìn)干細(xì)胞(stem cell)的維持和自我更新、干細(xì)胞特化和影響細(xì)胞系命運(yùn)決定。wnt信號(hào)途徑在干細(xì)胞發(fā)育,包括增殖、分化、調(diào)節(jié)等過(guò)程,和在肝及結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮非常重要的作用。肝干細(xì)胞(hepatic stem cell,HSC)具有分化成肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的雙向分化潛力。肝干細(xì)胞可能有三種去向:(1)通過(guò)自我更新,生成新的干細(xì)胞;(2)分化或演變?yōu)楦渭?xì)胞、膽管細(xì)胞;(3)肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞具有相同的肝臟微環(huán)境,在肝癌的模型和臨床病理中發(fā)現(xiàn)癌組織和癌旁組織含有肝干細(xì)胞。研究提示,分化程序錯(cuò)誤可能誘發(fā)肝癌,也就是說(shuō)肝癌細(xì)胞來(lái)源于肝干細(xì)胞。新近研究發(fā)現(xiàn)wnt信號(hào)途徑不僅調(diào)控干細(xì)胞增殖、分化,也調(diào)控癌干細(xì)胞(cancer stem cells,CSC)的增殖與分化。盡管wnt信號(hào)和肝干細(xì)胞如此重要的作用,但是肝干細(xì)胞是否存在wnt信號(hào)途徑的作用很少有人進(jìn)行研究,肝癌細(xì)胞漿和胞核β-catenin表達(dá)及分布目前的免疫組化檢測(cè)方法也不準(zhǔn)確,很少有人對(duì)比性研究肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞β-catenin表達(dá)和誘導(dǎo)分化方面的差異。因此,我們研究了肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞β-catenin表達(dá),細(xì)胞內(nèi)分布和誘導(dǎo)分化條件下兩種細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞分泌白蛋白和AFP功能及β-catenin分布的差異,探討wnt信號(hào)在肝干細(xì)胞分化與增殖,肝癌細(xì)胞增殖作用的差異性。 目的: 1.摸索較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的肝干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定分析方法。通過(guò)建立大鼠肝卵圓細(xì)胞的增殖模型,采用膠原酶消化法分離卵圓細(xì)胞,再經(jīng)過(guò)Percoll密度梯度離心純化,分離出肝卵圓細(xì)胞。進(jìn)行培養(yǎng)和肝干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定,期望得到下步試驗(yàn)所需要的肝干細(xì)胞,進(jìn)一步研究肝干細(xì)胞定向誘導(dǎo)向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化規(guī)律。 2.通過(guò)對(duì)wnt信號(hào)途徑的關(guān)鍵分子β-catenin在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)分布的比較,研究wnt信號(hào)在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞分布的差異及其對(duì)細(xì)胞增殖、分化作用的關(guān)系。證實(shí)wnt信號(hào)途徑對(duì)肝卵圓細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控作用。 3.通過(guò)肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞在誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞分泌白蛋白和AFP功能變化,及β-catenin分布的差異比較,研究β-catenin在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮的作用。 方法: 用AAF/PH建立了大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖模型,用膠原酶消化法自大鼠AAF/PH模型中分離單個(gè)肝卵圓細(xì)胞,經(jīng)過(guò)Percoll梯度離心純化肝卵圓細(xì)胞懸液,細(xì)胞懸液接種于0.2%明膠處理的含10%胎牛血清和含SCF 20ng/ml,HGF 10ng/ml,EGF 10ng/ml,LIF 10n妙ml的DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行增殖培養(yǎng)。新分離的肝卵圓細(xì)胞用免疫熒光和Western Blotting檢測(cè)c-kit干細(xì)胞抗原,RT-PCR法檢測(cè)其CK19和白蛋白抗原,對(duì)肝卵圓細(xì)胞進(jìn)行鑒定。采用免疫細(xì)胞化學(xué),免疫組織化學(xué)和Western Blotting技術(shù)檢測(cè)β-catenin在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的表達(dá)及其細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核分布,比較肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)分布的差異性。用含生長(zhǎng)因子SCF 20ng/ml,HGF10ng/ml,EGF 10n妙ml,地塞米松1.0×10~(-7)mol/L,1.5%DMSO,HSS 20n妙ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)液對(duì)進(jìn)行肝干細(xì)胞及肝癌細(xì)胞株的誘導(dǎo)分化,觀察誘導(dǎo)分化前后兩種細(xì)胞形態(tài)變化和β-catenin表達(dá)和細(xì)胞表達(dá)及分布的變化。 結(jié)果: 1.成功制造了大鼠AAF/PH肝卵圓細(xì)胞增殖模型,部分肝切除手術(shù)后11～12d取肝,經(jīng)過(guò)膠原酶IV消化肝組織和Percoll梯度離心肝細(xì)胞懸液等相對(duì)簡(jiǎn)單的方法提純肝卵圓細(xì)胞,所得細(xì)胞存活率90%,細(xì)胞數(shù)1.0×10~5～1.0×10~6/ml。新分離的肝卵圓細(xì)胞大小基本均勻,為卵圓形,其直徑相當(dāng)于成熟肝細(xì)胞1/4-1/6。免疫熒光技術(shù)和免疫印跡分析顯示新分離的肝卵圓細(xì)胞有c-kit抗原表達(dá),而成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞就無(wú)明顯的c-kit蛋白表達(dá)。RT-PCR分析顯示,成熟的肝細(xì)胞僅表達(dá)白蛋白mRNA,膽管上皮細(xì)胞僅表達(dá)CK19的mRNA,而新分離的肝卵圓細(xì)胞表達(dá)CK19和白蛋白基因mRNA,提示肝干細(xì)胞具有干細(xì)胞標(biāo)志和成熟的肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞的標(biāo)志,具有兩種分化的潛能。我們采用的AAF喂養(yǎng)大鼠方法、肝組織取材和消化、梯度離心和肝卵圓細(xì)胞培養(yǎng)方法與前人都有有明顯的改進(jìn)。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示W(wǎng)B大鼠肝干細(xì)胞、L_2肝細(xì)胞、SMCC-7721和HepG2人肝癌細(xì)胞胞膜和胞漿均有β-catenin表達(dá),而傳統(tǒng)的免疫組化對(duì)細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)不易分辨清楚。我們首次采用Western Blotting檢測(cè)四種細(xì)胞株和新分離的肝卵圓胞漿和胞核β-catenin,發(fā)現(xiàn)五種細(xì)胞胞漿均有明顯β-catenin表達(dá),HepG2和SMCC-7721肝癌細(xì)胞株灰色條帶較深,而肝細(xì)胞和肝干細(xì)胞灰色條細(xì)而淺,肝卵圓細(xì)胞漿只有少量β-catenin表達(dá)。HepG2和SMCC-7721細(xì)胞胞核β-catenin表達(dá)明顯,核內(nèi)條帶灰度甚至比細(xì)胞漿高,而WB和L2肝細(xì)胞僅有少量表達(dá),肝卵圓細(xì)胞核內(nèi)未檢測(cè)到β-catenin積聚,提示肝癌細(xì)胞漿和細(xì)胞核有β-catenin較高表達(dá)。 20例肝癌組織β-catenin免疫組化染色顯示細(xì)胞膜、細(xì)胞漿均有不同程度表達(dá),與正常組織和肝硬化的組織相比,有三個(gè)顯著特點(diǎn):①肝癌細(xì)胞膜β-catenin表達(dá)量明顯減少,胞膜分布不連續(xù),甚至缺如,細(xì)胞間界限不清楚:②細(xì)胞漿Qg明顯的β-catenin過(guò)表達(dá),且細(xì)胞漿分布不均勻。③隨肝癌分化程度不同,β-catenin表達(dá)也有明顯差異,高分化肝癌細(xì)胞膜β-catenin分布較為清楚連續(xù),細(xì)胞間有界限,細(xì)胞漿表達(dá)量較多,分布均勻。中度分化的肝癌細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin分布界與高低分化之間。低分化肝癌,β-catenin在細(xì)胞膜表達(dá)較少,細(xì)胞界限不清楚,細(xì)胞漿β-catenin分布不均勻,呈點(diǎn)狀積聚。 Western Blotting檢測(cè)肝癌細(xì)胞核β-catenin表達(dá)情況,結(jié)果顯示,正常組織細(xì)胞漿有β-catenin表達(dá),而細(xì)胞核未見(jiàn)明顯的β-catenin表達(dá),灰色條帶不明顯,而且6例肝癌組織(其中1例為低分化肝癌)細(xì)胞漿和細(xì)胞核β-catenin表達(dá)均較為明顯,核內(nèi)β-catenin條帶灰度甚至比細(xì)胞漿高,結(jié)果提示肝癌細(xì)胞漿β-catenin過(guò)表達(dá)和胞核β-catenin積聚。 3.從HepG2、SMCC-7721和WB細(xì)胞株誘導(dǎo)前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的變化看,相同時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)劑使細(xì)胞增殖提高1倍,而且在前五天生長(zhǎng)較快。WB肝干細(xì)胞株在誘導(dǎo)后第3d、5d、7d產(chǎn)生白蛋白較HepG2細(xì)胞高(P0.01、P0.05、P0.05),第5d產(chǎn)生白蛋白較SMCC-7721細(xì)胞高(P0.05),然而,這三種細(xì)胞在誘導(dǎo)期細(xì)胞株產(chǎn)生AFP的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。誘導(dǎo)后HepG2、SMCC-7721和WB細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)不同程度的變化,細(xì)胞變?yōu)槎嘈涡曰蜷L(zhǎng)梭狀,但始終未見(jiàn)象肝卵圓細(xì)胞那樣分化產(chǎn)生成熟的肝細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示誘導(dǎo)前后三種細(xì)胞株β-catenin的表達(dá)及胞膜、胞漿分布無(wú)明顯變化。新分離的肝卵圓細(xì)胞誘導(dǎo)分化第3d出現(xiàn)成熟的肝細(xì)胞,第5d出現(xiàn)類似膽管樣的長(zhǎng)梭形細(xì)胞。隨著時(shí)間延長(zhǎng),肝干細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,成熟的肝細(xì)胞增多,后期樹(shù)突樣膽管細(xì)胞為主。新分離的肝卵圓細(xì)胞加氯化鋰后,第3d肝卵圓細(xì)胞增殖加快,分化為成熟肝細(xì)胞數(shù)目較未加氯化鋰者少。Western Blotting檢測(cè)三種細(xì)胞株胞漿和胞核β-catenin表達(dá)條帶灰度與誘導(dǎo)前相近,肝卵圓細(xì)胞漿有少量表達(dá),胞核未見(jiàn)明顯β-catenin表達(dá)條帶。提示誘導(dǎo)分化劑對(duì)于三種細(xì)胞株,不象肝卵圓細(xì)胞那樣分化明顯,只是細(xì)胞形態(tài)和增殖速度的變化。兩種檢測(cè)結(jié)果提示對(duì)于增殖較快的細(xì)胞株和肝癌細(xì)胞,β-catenin在胞漿和胞核有較高的表達(dá)和分布,而較易分化的肝卵圓細(xì)胞胞漿表達(dá)β-catenin量少,胞核無(wú)明顯β-catenin積聚。 結(jié)論: 1.本研究成功制造了大鼠AAF/PH肝干細(xì)胞增殖模型,建立了利用簡(jiǎn)單實(shí)用分離肝干細(xì)胞的方法。不僅注意到肝干細(xì)胞直徑只有成熟肝細(xì)胞的1/4～1/6,其具有干細(xì)胞的標(biāo)志,具有成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的標(biāo)志,即有向兩個(gè)方向分化的潛能,而且經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)更清楚的觀察到肝卵圓細(xì)胞分化成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的細(xì)胞體積和形態(tài)的變化過(guò)程。 2.本實(shí)驗(yàn)使用western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞漿和胞核β-catenin表達(dá),比免疫組化更精確和直觀,結(jié)合免疫組化對(duì)細(xì)胞膜和胞漿β-catenin表達(dá),更準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核分布。肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞在β-catenin表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)分布具有明顯差異,肝干細(xì)胞胞膜分布均勻連續(xù),胞漿有少量表達(dá),胞核內(nèi)沒(méi)有積聚。而癌細(xì)胞胞膜β-catenin分布不均勻、不連續(xù)甚至缺如,細(xì)胞分化越差胞膜β-catenin分布越少,肝癌細(xì)胞漿存在β-catenin過(guò)度表達(dá),胞核內(nèi)β-catenin積聚非常明顯。這種細(xì)胞β-catenin分布的差異決定其生物學(xué)行為的不同,肝癌胞膜β-catenin分布越少可能與癌細(xì)胞易肝內(nèi)血行轉(zhuǎn)移有關(guān),胞核內(nèi)β-catenin積聚使癌細(xì)胞增殖快,分化不良等癌高度惡性可能有聯(lián)系。研究結(jié)果提示β-catenin在肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)分布與其增殖速度和分化程度有很大關(guān)系。 3.肝卵圓細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生成熟肝細(xì)胞和膽管上皮樣細(xì)胞,分化過(guò)程中干細(xì)胞具有體積由小到大,細(xì)胞形態(tài)也有較大改變的過(guò)程。對(duì)此過(guò)程的認(rèn)識(shí),有利于肝癌可能起源于肝干細(xì)胞理解,這與過(guò)去認(rèn)為肝癌起源于體積大而成熟的肝細(xì)胞有很大差異。肝卵圓細(xì)胞存在β-catenin表達(dá),氯化鋰可使肝卵圓細(xì)胞增值加快,分化卻受到抑制,證實(shí)了肝干細(xì)胞同樣存在β-catenin信號(hào)途徑,而且也可能調(diào)控肝干細(xì)胞的增殖和分化。 4.從某些方面看,肝干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)有差異,也有共性。肝干細(xì)胞株具有永生性生長(zhǎng)的能力,誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液中多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)其相應(yīng)受體激活胞漿β-catenin信號(hào),促進(jìn)細(xì)胞的增殖。肝干細(xì)胞株增殖速度較快,具有癌細(xì)胞的胞漿和胞核β-catenin積聚的特征,所不同的是細(xì)胞膜分布均勻連續(xù),又具有良性細(xì)胞的特性。原代的肝卵圓細(xì)胞和肝干細(xì)胞株在β-catenin表達(dá)及細(xì)胞膜和胞漿分布相似,肝癌組織和肝癌細(xì)胞株β-catenin胞膜、胞漿和胞核相似,這兩種類型細(xì)胞增殖和分化狀態(tài)都與β-catenin表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)亞分布有關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R735.7;R575
【圖文】：

提示肝癌細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有p一。atenin較高表達(dá)。 HePGZSMCCWBLZHOC圖2一10五種細(xì)胞胞漿p一catenin蛋白表達(dá)HepGZ:HepGZ人肝癌細(xì)胞株;SMee:SMee一7721WB:WB鼠肝干細(xì)胞株;LZ:鼠肝細(xì)胞株;HOC:人肝癌細(xì)胞株鼠肝卵圓細(xì)胞HePGZ SMCCWB LZHOC圖2一11四種細(xì)胞胞核p一catenin蛋白表達(dá)HepGZ:HepGZ人肝癌細(xì)胞株;SMCC:SMCC一7721人肝癌細(xì)胞株WB:WB鼠肝干細(xì)胞株;LZ:鼠肝細(xì)胞株;HOC:鼠肝卵圓細(xì)胞三、免疫組化檢測(cè)卜catenin在不同肝組織的表達(dá)正常肝組織排列較為整齊，肝板結(jié)構(gòu)清楚，肝小葉可見(jiàn)，肝細(xì)胞大小一致，細(xì)胞很少有空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞之間分界清楚。p一catenin在細(xì)胞膜顯示清晰、完整，分布均勻，細(xì)胞界限清楚，細(xì)胞漿內(nèi)有少量的p一catenin分布(圖2一12)。細(xì)胞核用蘇木素襯染后呈淺紫色，難以分辨核p一catenin分布情況。肝硬化組織的肝板結(jié)構(gòu)仍然清楚，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞大小不一致，細(xì)胞內(nèi)有空泡變性，但細(xì)胞之間界限清楚，與正常肝組織有相似之處。p一catenin在細(xì)胞膜顯示清晰、完整

胞漿成分減少。細(xì)胞核內(nèi)p一catenin分布用一般的免疫組化法不易分辨清楚;③隨肝癌分化程度不同，p一。atenin表達(dá)也有明顯差異，高分化肝癌細(xì)胞膜p一catenin分布較為清楚連續(xù)，細(xì)胞間有界限，細(xì)胞漿表達(dá)量較多，分布均勻(圖2一巧)。中度分化的肝癌細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)p一。atenin分布界與高低分化之間(圖2一16，2一17)。低分化肝癌，p一catenin在細(xì)胞膜表達(dá)較少細(xì)胞界限不清楚，細(xì)胞漿p一catenin分布不均勻，呈點(diǎn)狀積聚(圖2一18，2一19)。四、W七sternB一otting檢測(cè)肝組織內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核p·catenin表達(dá)鑒于免疫組化檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)p一catenin有困難，我們首次采用 WesternBlotting法檢測(cè)肝癌細(xì)胞核p一catenin表達(dá)情況。結(jié)果顯示，正常組織細(xì)胞漿有p一。atenin表達(dá)

二J八 UOn.l目n乙q乙 11.1.

本文編號(hào)：2777818