【摘要】：肝纖維化是肝臟對(duì)各種原因所致肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng),表現(xiàn)為肝內(nèi)結(jié)締組織增生與沉積�，F(xiàn)代研究表明,現(xiàn)在常見(jiàn)多發(fā)的急,慢性肝病例如病毒型肝炎,脂肪肝,酒精肝等大部分病例在早期都表現(xiàn)為肝纖維化,如果不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并有效抑制,就會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化乃至肝癌,直接危及患者生命。所以阻止或者延緩肝纖維化的發(fā)生,就可以治愈大多數(shù)慢性肝病[1]。而正常肝細(xì)胞損傷現(xiàn)在被視為激活肝纖維化的最初信號(hào),并且隨著肝細(xì)胞的持續(xù)受損,肝纖維化將不斷加劇。因此尋找合適的治療靶點(diǎn)阻止肝損傷,治療肝損傷對(duì)臨床肝病的治療有非常重要的意義。[2] 肝細(xì)胞的氧化損傷的發(fā)生是肝纖維化的早期的病理過(guò)程,肝纖維化是肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織增生導(dǎo)致的慢性疾病,在肝纖維化的病理過(guò)程中,肝星形細(xì)胞的激活,是其顯著的特征,而肝細(xì)胞的氧化損傷和凋亡往往是肝纖維化發(fā)生的始動(dòng)因素。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucose regulated protein75, Grp75)是細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的一種重要的分子伴侶,在缺糖、輻射等應(yīng)激條件下,Grp75呈上調(diào)表達(dá),以起到保護(hù)蛋白質(zhì),協(xié)助蛋白質(zhì)(特別是線粒體蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)運(yùn),提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激反應(yīng)耐受性的作用[3]。Grp75在缺糖損傷時(shí)Grp75通過(guò)減少ROS (reactive oxygen species)和脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生,以及增加ATP (adenosine triphosphate)水平保護(hù)細(xì)胞[4]。 Grp75在心臟、腦、肺、脾等多種組織中有構(gòu)成性表達(dá),當(dāng)細(xì)胞損傷發(fā)生時(shí),伴侶分子Grp75可以應(yīng)激性上調(diào),起到細(xì)胞保護(hù)效應(yīng),抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程[5]。然而Grp75在肝組織中卻沒(méi)有構(gòu)成性表達(dá),因此為探究Grp75在肝細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí),對(duì)細(xì)胞和整體動(dòng)物的保護(hù)作用,我們首先構(gòu)建Grp75/EGFP-N2質(zhì)粒并用Lipofectamine2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HL-7702細(xì)胞,通過(guò)G418篩選得到穩(wěn)定Grp75過(guò)表達(dá)細(xì)胞株,隨后加入400umH2O2制造肝細(xì)胞氧化損傷模型,通過(guò)對(duì)MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide]的檢測(cè)鑒定細(xì)胞活力[6],結(jié)果顯示在H202刺激下Grp75過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的細(xì)胞活力要比HL-7702細(xì)胞要高。通過(guò)比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase)這提示我們Grp75可以保護(hù)在H202刺激下的肝細(xì)胞。為探究其作用機(jī)制我們分別檢測(cè)了細(xì)胞中ATP, ROS,線粒體膜電位,和Cytochrome C等線粒體功能相關(guān)指標(biāo)。ATP檢測(cè)顯示,在H202誘導(dǎo)下Grp75過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的ATP生成量要明顯高于HL-7702細(xì)胞。ROS水平檢測(cè)顯示,在H202誘導(dǎo)下Grp75過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生要明顯小于對(duì)照組HL-7702細(xì)胞,提示在H202誘導(dǎo)下Grp75可以抑制細(xì)胞中ROS的生成。通過(guò)JC-1(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)標(biāo)記線粒體膜電位,從而觀察線粒體膜電位變化,結(jié)果顯示在H2O2誘導(dǎo)下Grp75的膜電位崩解趨勢(shì)要比對(duì)照組HL-7702細(xì)胞株要低,提示Grp75可以保護(hù)細(xì)胞中線粒體膜電位。通過(guò)Western blo險(xiǎn)測(cè)細(xì)胞胞漿中Cytochrome C的水平,結(jié)果顯示在H202刺激條件下,Crp75過(guò)表達(dá)組細(xì)胞胞漿中Cytochrome C水平明顯比較對(duì)照HL-7702細(xì)胞株要低,說(shuō)明Crp75可以抑制線粒體中Cytochrome C的釋放。以上結(jié)果說(shuō)明Grp75可以通過(guò)促進(jìn)ATP的生成,抑制ROS生成,保護(hù)線粒體膜電位和抑制細(xì)胞中Cytochrome C的釋放從而達(dá)到保護(hù)肝細(xì)胞的目的。 為了在整體水平驗(yàn)證以上結(jié)果,我們將100-150g雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為四組,其中兩組用jetPEI-in vivo通過(guò)尾靜脈注射將Grp75定向轉(zhuǎn)染入大鼠肝臟中以構(gòu)造Grp75肝臟過(guò)表達(dá)大鼠,CCL4(carbon tetrachloride)誘導(dǎo)肝纖維化,免疫組化檢測(cè)組織中Grp75表達(dá)量,組織學(xué)HE染色鑒定肝臟損傷,血清AST,ALT檢測(cè)肝損傷；ATP, Cytochrome C檢測(cè)肝組織線粒體功能。免疫組化結(jié)果顯示,在正常組大鼠中Grp75幾乎沒(méi)有表達(dá),在CCL4組中有Grp75表達(dá),其表達(dá)量與Grp75過(guò)表達(dá)組中基本相似,在CCL4誘導(dǎo)下Grp75過(guò)表達(dá)組中Grp75表達(dá)最高。組織學(xué)HE染色結(jié)果表明在CCL4誘導(dǎo)下,與對(duì)照組大鼠相比,Grp75過(guò)表達(dá)組大鼠的肝臟中,匯管區(qū)聚集減輕,組織中空泡狀結(jié)構(gòu)減輕,纖維組織增生較少,纖維間隔減少,表明Grp75可以抑制CCL4所誘導(dǎo)的肝損傷。檢測(cè)肝臟組織中ATP和Cytochrome C我們得到與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果,這說(shuō)明在整體水平Grp75可以通過(guò)促進(jìn)ATP的生成,抑制細(xì)胞中的Cytochrome C的釋放從而達(dá)到保護(hù)肝臟的目的。 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)Grp75可以通過(guò)改善線粒體功能從而對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷起到保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：2777768