【摘要】：肝纖維化是肝臟對各種原因所致肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng),表現(xiàn)為肝內(nèi)結(jié)締組織增生與沉積�，F(xiàn)代研究表明,現(xiàn)在常見多發(fā)的急,慢性肝病例如病毒型肝炎,脂肪肝,酒精肝等大部分病例在早期都表現(xiàn)為肝纖維化,如果不能及時發(fā)現(xiàn)并有效抑制,就會進一步發(fā)展成為肝硬化乃至肝癌,直接危及患者生命。所以阻止或者延緩肝纖維化的發(fā)生,就可以治愈大多數(shù)慢性肝病[1]。而正常肝細胞損傷現(xiàn)在被視為激活肝纖維化的最初信號,并且隨著肝細胞的持續(xù)受損,肝纖維化將不斷加劇。因此尋找合適的治療靶點阻止肝損傷,治療肝損傷對臨床肝病的治療有非常重要的意義。[2] 肝細胞的氧化損傷的發(fā)生是肝纖維化的早期的病理過程,肝纖維化是肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織增生導(dǎo)致的慢性疾病,在肝纖維化的病理過程中,肝星形細胞的激活,是其顯著的特征,而肝細胞的氧化損傷和凋亡往往是肝纖維化發(fā)生的始動因素。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucose regulated protein75, Grp75)是細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的一種重要的分子伴侶,在缺糖、輻射等應(yīng)激條件下,Grp75呈上調(diào)表達,以起到保護蛋白質(zhì),協(xié)助蛋白質(zhì)(特別是線粒體蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)運,提高細胞對應(yīng)激反應(yīng)耐受性的作用[3]。Grp75在缺糖損傷時Grp75通過減少ROS (reactive oxygen species)和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,以及增加ATP (adenosine triphosphate)水平保護細胞[4]。 Grp75在心臟、腦、肺、脾等多種組織中有構(gòu)成性表達,當細胞損傷發(fā)生時,伴侶分子Grp75可以應(yīng)激性上調(diào),起到細胞保護效應(yīng),抑制細胞凋亡進程[5]。然而Grp75在肝組織中卻沒有構(gòu)成性表達,因此為探究Grp75在肝細胞發(fā)生損傷時,對細胞和整體動物的保護作用,我們首先構(gòu)建Grp75/EGFP-N2質(zhì)粒并用Lipofectamine2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HL-7702細胞,通過G418篩選得到穩(wěn)定Grp75過表達細胞株,隨后加入400umH2O2制造肝細胞氧化損傷模型,通過對MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide]的檢測鑒定細胞活力[6],結(jié)果顯示在H202刺激下Grp75過表達組細胞的細胞活力要比HL-7702細胞要高。通過比色法檢測細胞培養(yǎng)基上清中AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase)這提示我們Grp75可以保護在H202刺激下的肝細胞。為探究其作用機制我們分別檢測了細胞中ATP, ROS,線粒體膜電位,和Cytochrome C等線粒體功能相關(guān)指標。ATP檢測顯示,在H202誘導(dǎo)下Grp75過表達組細胞的ATP生成量要明顯高于HL-7702細胞。ROS水平檢測顯示,在H202誘導(dǎo)下Grp75過表達組細胞中ROS的產(chǎn)生要明顯小于對照組HL-7702細胞,提示在H202誘導(dǎo)下Grp75可以抑制細胞中ROS的生成。通過JC-1(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)標記線粒體膜電位,從而觀察線粒體膜電位變化,結(jié)果顯示在H2O2誘導(dǎo)下Grp75的膜電位崩解趨勢要比對照組HL-7702細胞株要低,提示Grp75可以保護細胞中線粒體膜電位。通過Western blo險測細胞胞漿中Cytochrome C的水平,結(jié)果顯示在H202刺激條件下,Crp75過表達組細胞胞漿中Cytochrome C水平明顯比較對照HL-7702細胞株要低,說明Crp75可以抑制線粒體中Cytochrome C的釋放。以上結(jié)果說明Grp75可以通過促進ATP的生成,抑制ROS生成,保護線粒體膜電位和抑制細胞中Cytochrome C的釋放從而達到保護肝細胞的目的。 為了在整體水平驗證以上結(jié)果,我們將100-150g雌性Wistar大鼠隨機分為四組,其中兩組用jetPEI-in vivo通過尾靜脈注射將Grp75定向轉(zhuǎn)染入大鼠肝臟中以構(gòu)造Grp75肝臟過表達大鼠,CCL4(carbon tetrachloride)誘導(dǎo)肝纖維化,免疫組化檢測組織中Grp75表達量,組織學(xué)HE染色鑒定肝臟損傷,血清AST,ALT檢測肝損傷；ATP, Cytochrome C檢測肝組織線粒體功能。免疫組化結(jié)果顯示,在正常組大鼠中Grp75幾乎沒有表達,在CCL4組中有Grp75表達,其表達量與Grp75過表達組中基本相似,在CCL4誘導(dǎo)下Grp75過表達組中Grp75表達最高。組織學(xué)HE染色結(jié)果表明在CCL4誘導(dǎo)下,與對照組大鼠相比,Grp75過表達組大鼠的肝臟中,匯管區(qū)聚集減輕,組織中空泡狀結(jié)構(gòu)減輕,纖維組織增生較少,纖維間隔減少,表明Grp75可以抑制CCL4所誘導(dǎo)的肝損傷。檢測肝臟組織中ATP和Cytochrome C我們得到與細胞實驗相似的結(jié)果,這說明在整體水平Grp75可以通過促進ATP的生成,抑制細胞中的Cytochrome C的釋放從而達到保護肝臟的目的。 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)Grp75可以通過改善線粒體功能從而對肝細胞氧化損傷起到保護作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575.2

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本文編號：2777768