【摘要】：乙型和丙型肝炎病毒(Hepatitis B／C Virus，HBV／HCV)是引起肝硬化、原發(fā)性肝細(xì)胞癌等疾病的主要因素。在我國(guó)僅HBV慢性感染者就有1.25億，HCV感染者也高達(dá)3800萬。每年有大量的肝硬化病人死于包括原發(fā)性肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種并發(fā)癥。病毒感染者通常會(huì)經(jīng)歷病毒性肝炎——肝硬化——肝癌的典型病程，然而這一病程的確切機(jī)制并不清楚。病毒感染人體后與宿主細(xì)胞發(fā)生復(fù)雜的相互作用，其中涉及宿主細(xì)胞的多種基因、多種信號(hào)途徑。分析感染后病變肝臟細(xì)胞基因的表達(dá)變化，不僅可以從一定程度上理解病毒致病的分子生物學(xué)，而且也為揭示病毒性肝硬化、原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)。同時(shí)這些差異表達(dá)的基因則可能成為新的肝病診斷標(biāo)志或治療靶點(diǎn)。 本研究選取正常肝臟組織和肝硬化組織(乙型肝炎病毒表面抗原陽性)、原發(fā)性肝細(xì)胞癌及癌旁組織(丙型肝炎病毒抗體陽性、核酸陽性)為研究對(duì)象，綜合多個(gè)研究者對(duì)代表性差異分析(representational difference analysis，RDA)技術(shù)的改進(jìn)方案分別進(jìn)行了兩組研究標(biāo)本正向和反向的消減雜交，兩輪雜交后的產(chǎn)物被克隆到pGEM-T載體中。挑取部分陽性克隆制備雜交膜，分別以同位素標(biāo)記來源于各研究標(biāo)本的擴(kuò)增子以及第二輪雜交產(chǎn)物為探針，進(jìn)行高通量的斑點(diǎn)雜交，獲得多個(gè)差異表達(dá)的基因：(1)在肝硬化組織中上調(diào)的基因包括谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(glutaminase 1)、醛糖還原酶(aldo-keto reductase family 1 B10，AKR1B10)、鈣結(jié)合的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)蛋白(calcium-binding tyrosine 博士學(xué)位論文摘要 phosphorylation一regulated protein，CABYR)、雌激素應(yīng)答B(yǎng)盒蛋白(Estrogen responsive B box protein，EBBP)等基因以及兩個(gè)對(duì)應(yīng)于新基因的EST(expressed sequenee tag)片段等。下調(diào)表達(dá)的基因包括CD27結(jié)合蛋白(CD27 binding proteinSivas鸇27BP)和煙酞胺甲基轉(zhuǎn)移酶(nieotinamide N一methyltransferase，NNMT)等。(2)在肝癌組織中上調(diào)表達(dá)的基因有微管蛋白 (gamma一tubulin)，絲氨酸脫氫酶(serine dehydratase，SDS)，P450色素家 族蛋白(eytoehrome P450，fami ly 11，subfamilyB，PolypeptideZ，CYPXIBZ)。 下調(diào)表達(dá)的基因包括與外毒素酶解代謝以及血漿蛋白的合成的相關(guān)基因以及腫瘤 相關(guān)基因絲氨酸蛋白酶11(protease，serine 11，HTRA serine protease，pRSSll)、 原肌球蛋白一1(Tropomyosin一l，TM一l)以及兩個(gè)對(duì)應(yīng)于新基因的EST片段等。選擇 部分基因進(jìn)一步用半定量RT一PCR的方法鑒定其在相應(yīng)類型標(biāo)本中的表達(dá)。CABYR 基因在正常肝臟中不表達(dá)，而在所有的13份肝硬化組織中都激活表達(dá)，同時(shí)鈣結(jié) 合的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)蛋白基因在7/9的肝癌組織中上調(diào)表達(dá)，表明該基因于轉(zhuǎn) 錄水平上在肝病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。目前尚未有這一基因參與包括肝病在內(nèi)的 人類疾病的相關(guān)研究。PRSS 11、TM一1基因在9份肝癌組織中呈現(xiàn)了不同的表達(dá)模 式。 通過本研究，可以得出如下結(jié)論:(1)利用RDA技術(shù)分離獲得多個(gè)參與病毒 性肝硬化、肝癌發(fā)生的基因，其中包括一些新基因，EBBP、CABYR以及PRSSll基 因參與肝病的發(fā)生為我們首次報(bào)道。CABYR基因及其表達(dá)產(chǎn)物在肝癌發(fā)生中的作用 有待進(jìn)一步研究。(2)結(jié)合RDA和高通量的再篩選可以有效分析細(xì)胞在病理狀態(tài)下 差異表達(dá)的基因，是了解宿主和病毒相互作用的有效方法。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R575.2;R735.7
【圖文】：

用于雜交的兩種擴(kuò)增子范圍一致，適合于進(jìn)一步的分析。在實(shí)驗(yàn)中通過縮小雜交體系的規(guī)模，即將每輪所用驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增子的量從40pg減少到5pg，大大減少了所需起始樣本的量。圖1一1顯示了來源于100“g總RNA在稀釋PcR法川以及1:100、1:800二輪雜交后，可以有效地富集大量的差異基因。參照文獻(xiàn)〔2，，為保留差異基因的多樣性，我們沒有進(jìn)行更高比率的雜交。同時(shí)，正反向雜交產(chǎn)物顯示了不同產(chǎn)物模式，表明雜交的過程中沒有DNA污染。bP2000一n﨑一UO

本文編號(hào)：2776344