【摘要】： 各種原因?qū)е碌母嗡ソ呤殖Ｒ?內(nèi)科綜合治療療效差。人工肝支持系統(tǒng)是治療肝衰竭的重要方法之一,以培養(yǎng)肝細胞為核心的生物人工肝可暫時替代肝臟功能,清除有害物質(zhì),補充生物活性物質(zhì)。目前用于臨床研究的肝細胞材料主要有豬肝細胞、從HepG2細胞獲得的C3A細胞系。采用C3A細胞的ELAD生物人工肝臨床研究顯示對肝衰竭患者有一定療效,但治療過程中有出血、過敏、凝血等不良反應(yīng)。為完善肝細胞的功能,本課題將人肝再生增強因子(hALR)應(yīng)用于生物人工肝細胞材料中,構(gòu)建體外生物人工肝支持系統(tǒng)(BLASS),以期增強肝細胞分泌肝再生增強因子的能力,提高生物人工肝的療效。 1.pcDNA3.1(-)hALR重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定ALR是一種熱穩(wěn)定細胞因子,它能促進肝細胞增殖和肝臟再生、抑制NK細胞活性,對受損的肝細胞具有很強的保護作用。本試驗從肝組織中提取RNA,RT-PCR擴增出hALR片段,克隆至真核表達載體pcDNA3.1(-),構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)hALR,經(jīng)測序、雙酶切等方法鑒定,符合應(yīng)用要求。 2.hALR肝細胞系的建立及功能評價采用有限稀釋法和利多卡因轉(zhuǎn)化等方法篩選HepG2細胞,挑選出一株生長旺盛、有一定利多卡因代謝功能的細胞,然后轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)hALR,經(jīng)G418篩選,在體外培養(yǎng)50代后,進一步對其合成、代謝、解毒等功能評價。結(jié)果顯示:該細胞系功能穩(wěn)定,形態(tài)良好,生長旺盛,24h利多卡因轉(zhuǎn)化率65%,安定轉(zhuǎn)化率79.33%。間接免疫熒光實驗證實hALR在肝細胞胞漿中大量存在。轉(zhuǎn)染后的肝細胞生長速度、白蛋白合成能力等均較轉(zhuǎn)染hALR之前肝細胞有所增強。培養(yǎng)72h后,肝細胞上清液中AFP可升高至118.0±56ng/ml。免疫斑點印跡法檢測到其培養(yǎng)上清液中ALR蛋白水平升高。另外該肝細胞系可在體外大量、快速增殖,基本符合生物人工肝細胞材料的要求。 3.hALR肝細胞系的生物反應(yīng)器培養(yǎng)用已建立的hALR肝細胞系為細胞材料,以費森尤斯公司的P2S血漿濾過器為中空纖維反應(yīng)器,反應(yīng)器中預(yù)先裝入存活率95%以上、總量1×10~8個肝細胞。用管路連接蠕動泵、肝細胞培養(yǎng)液等,構(gòu)建生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)系統(tǒng),對肝細胞在反應(yīng)器中的生長及功能進行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)保持完整,并有一定的合成白蛋白、甲胎蛋白、尿素氮等作用。培養(yǎng)72h后細胞數(shù)升至7.60×10~8,96h后為9.02×10~8,細胞存活率分別為92%和95%,在倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察下可見細胞能較好粘附在中空纖維上。24h利多卡因轉(zhuǎn)化率88.4%,細胞培養(yǎng)液的細菌和支原體檢測均未發(fā)現(xiàn)異常。 4.離線型生物人工肝支持系統(tǒng)的構(gòu)建及對肝衰竭患者血漿體外治療的初步研究我們采用“離線”方法,在體外對血漿置換后廢棄血漿進行膽紅素吸附,然后采用血漿代替培養(yǎng)液,對生物反應(yīng)器中hALR肝細胞進行培養(yǎng),充分利用肝細胞的代謝、解毒和合成功能。結(jié)果顯示:治療前血漿TBil為332.22±22.54umol/L,膽紅素吸附后TBil為295.6±128.7μmol/L(P＜0.01),白蛋白、BUN、血糖等變化無顯著性差異。離線生物人工肝治療前血漿中TBil、AFP和白蛋白值分別是295.6±128.7μmol/L,21.2±17.5ng/ml和26.44±2.186g/L,經(jīng)4～6h治療后,上述指標分別為239.4±103.9μmol/L(P＜0.05),102±62.8ng/ml(P＜0.01)和32.44±2.29g/L(P＜0.05)。結(jié)果提示本離線型生物人工肝支持系統(tǒng)具有降低膽紅素,增加白蛋白、尿素、AFP的合成等作用。 本項目成功構(gòu)建hALR重組質(zhì)粒,篩選出表達hALR的肝細胞系,并構(gòu)建生物反應(yīng)器及離線式生物人工肝支持系統(tǒng),對肝衰竭患者血漿進行研究。本研究可簡化生物人工肝制備的難度和方法,減少血漿消耗,從而提高人工肝的質(zhì)控和安全性,為生物人工肝在肝衰竭治療中的廣泛開展和應(yīng)用開辟新的途徑。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575.3
【圖文】：

圖2一3轉(zhuǎn)染hALR重組質(zhì)粒前后的肝細胞生長情的肝細胞系代謝功能檢測轉(zhuǎn)化實驗應(yīng)用looml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液10ml，測利多卡因濃度，結(jié)果見表2一1。hALR肝細胞系的利多卡因代謝轉(zhuǎn)化結(jié)果利多卡因濃度(mg/L)利多卡因轉(zhuǎn)化oh80078632.521.25562842.5654hhhZh，‘漢一‘.且，山

BCA標準品檢測的標準曲線圖

llldZd3d4ddd培 培養(yǎng)時間間圖2一6轉(zhuǎn)染hALR重組質(zhì)粒前后肝細胞培養(yǎng)液上清中人白蛋白含量

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 John Brotherton;美國C3A細胞支持的生物人工肝研究進展[J];實用肝臟病雜志;2005年05期

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本文編號：2776246