【摘要】：第一部分:簡易膠原酶消化法提取兔原代肝細(xì)胞及培養(yǎng)目的:探討簡易、經(jīng)濟(jì)的Ⅳ型膠原酶消化法提取分離新生兔原代肝細(xì)胞及體外培養(yǎng)。方法:采用0.1%Ⅳ型膠原酶對新生兔肝臟組織小塊進(jìn)行消化以提取兔原代肝細(xì)胞,體外進(jìn)行單層培養(yǎng),并對提取的兔肝細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測。結(jié)果:提取的肝細(xì)胞主要呈類圓形,排列整齊,細(xì)胞透亮有光澤,立體感好,細(xì)胞界限清晰。1g肝組織可分離1.12X106個肝細(xì)胞,成活率為77%。細(xì)胞增殖能力呈先升后降趨勢,細(xì)胞生長曲線較符合原代細(xì)胞生長的一般規(guī)律。結(jié)論:該實驗方法簡單、易操作,無需特殊設(shè)備,適合一般實驗室開展原代肝細(xì)胞的提取、分離與培養(yǎng)。第二部分:3D生物打印技術(shù)在構(gòu)建兔原代肝細(xì)胞水凝膠結(jié)構(gòu)體片段上的研究目的:通過三維(3D)生物打印兔原代肝細(xì)胞—海藻酸鈉—明膠共混物,探究3D生物打印技術(shù)構(gòu)建類肝水凝膠結(jié)構(gòu)體片段的可行性。方法:采用Ⅳ型膠原酶消化法提取分離新生兔原代肝細(xì)胞;制備海藻酸鈉—明膠水溶膠,與兔原代肝細(xì)胞共混;采用圓柱狀微絲逐層交錯堆積技術(shù),進(jìn)行兔肝細(xì)胞—海藻酸鈉—明膠共混物的3D生物打印,獲得三維結(jié)構(gòu)體。用鈣黃綠素—AM和碘化丙啶(PI)溶液對該結(jié)構(gòu)體進(jìn)行活/死細(xì)胞雙熒光染色,評價打印后及培養(yǎng)后兔肝細(xì)胞的活性,計算細(xì)胞存活率。結(jié)果:通過按照設(shè)計的參數(shù),打印出含有兔原代肝細(xì)胞的網(wǎng)格狀水凝膠結(jié)構(gòu)體。該結(jié)構(gòu)體的規(guī)格為10 mm×10 mm×1.2 mm,微絲間的孔隙相互通連,孔隙大小約450μ m×450μ m。打印后的兔肝細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)體中仍可增殖,活/死細(xì)胞熒光染色結(jié)果表明結(jié)構(gòu)體中兔肝細(xì)胞的存活率為82%±3%,兔原代肝細(xì)胞在結(jié)構(gòu)體中分布均勻。結(jié)論:本研究實現(xiàn)了兔肝細(xì)胞共混物結(jié)構(gòu)體的3D生物打印,為構(gòu)建類肝組織工程結(jié)構(gòu)體片段提供新思路。第三部分:四氯化碳皮下注射誘導(dǎo)兔肝纖維化模型目的:采用四氯化碳(CCl4)皮下注射誘導(dǎo)兔肝纖維化模型。方法:36只新西蘭白兔隨機分組:實驗組30只、對照組6只。實驗組開始2周頸背部皮下注射50%CC14橄欖油0.3 mL/kg,隨后10周注射0.2 mL/kg,每周各2次;對照組注射等量橄欖油。實驗組及對照組分別于第4、8、12周末,檢測兔肝臟功能生化指標(biāo)的變化,以及肝臟大體和組織病理學(xué)變化,觀察肝纖維化的發(fā)展程度。結(jié)果:造模期間實驗組家兔死亡6只,動物死亡率20%,對照組家兔無死亡。實驗組兔肝臟纖維化程度隨造模時間延長而逐漸加重,血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶均明顯升高,肝組織出現(xiàn)假小葉結(jié)構(gòu),造模成功率為80%。對照組肝臟功能以及組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常。結(jié)論:長期持續(xù)給予CC14可導(dǎo)致家兔的肝纖維化形成,成模率較高,并有較明顯的階段性變化,可進(jìn)一步用于相關(guān)實驗研究。第四部分:3D生物打印的肝結(jié)構(gòu)體植入肝纖維化兔的研究目的:通過將三維(3D)生物打印的類肝水凝膠結(jié)構(gòu)體,經(jīng)肝表面貼覆法植入肝纖維化兔模型,探討改善肝纖維化,以及形成類肝組織結(jié)構(gòu)的可行性。方法:采用兔離體肝臟膠原酶消化法提取兔原代肝細(xì)胞,并采用四氯化碳(CCl4)皮下注射誘導(dǎo)兔肝纖維化模型。3D生物打印兔肝細(xì)胞-海藻酸鈉-明膠3D水凝膠網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)體片段,經(jīng)肝表面貼覆法植入肝纖維化兔。植入16天后,檢測兔肝功能生化指標(biāo)及肝臟組織病理學(xué)變化,觀察肝纖維化的發(fā)展程度,以及類肝組織結(jié)構(gòu)形成情況觀察。結(jié)果:兔肝細(xì)胞水凝膠支架體內(nèi)植入16天后,可見每個植入物大部分質(zhì)量尚未降解,未降解的植入物與肝臟貼合緊密,融合生長。通過檢測兔肝功能生化指標(biāo)及植入物之下的肝臟組織病理學(xué)觀察,表明兔肝細(xì)胞-3D水凝膠支架植入使兔肝臟纖維化程度及其肝功能生化指標(biāo)有所改善,但各組之間比較均P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。組織學(xué)觀察結(jié)果表明,實驗組植入物中肝細(xì)胞均勻分布,未見細(xì)胞變性及死亡,可形成類肝組織結(jié)構(gòu)。結(jié)論:3D生物打印的肝結(jié)構(gòu)體具有再造肝樣組織片段和實現(xiàn)部分肝功能的潛力,將于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床之間搭建橋梁,為肝臟再生打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575
【圖文】：

體積增大，部分細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞三五成群連接生長（圖２）。５ｄ后，長逡逑出許多新生細(xì)胞，逐漸成鋪路石狀成片生長（圖３）；邋８ｄ后，細(xì)胞開始有老化現(xiàn)象，并逡逑有死細(xì)胞出現(xiàn)（圖４）；邋ｌＴｌ５ｄ，細(xì)胞出現(xiàn)黑色顆粒狀物質(zhì)和空泡，逐漸死亡脫落（圖５，逡逑圖６）。逡逑■邋■逡逑圖１初分離的新生兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邋圖２培養(yǎng)３天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ邋４００）逡逑■邋■逡逑圖３培養(yǎng)５天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邐圖４培養(yǎng)８天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）逡逑桯暴＿．．＿媝逡逑圖５培養(yǎng)１１天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邋圖Ｇ培養(yǎng)１５天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）逡逑１３逡逑

細(xì)胞清晰（圖１）。接種４邋ｈ后細(xì)胞開始貼壁。培養(yǎng)３ｄ后，細(xì)胞拉平伸展，形逡逑狀不規(guī)則，體積增大，部分細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞三五成群連接生長（圖２）。５ｄ后，長逡逑出許多新生細(xì)胞，逐漸成鋪路石狀成片生長（圖３）；邋８ｄ后，細(xì)胞開始有老化現(xiàn)象，并逡逑有死細(xì)胞出現(xiàn)（圖４）；邋ｌＴｌ５ｄ，細(xì)胞出現(xiàn)黑色顆粒狀物質(zhì)和空泡，逐漸死亡脫落（圖５，逡逑圖６）。逡逑■邋■逡逑圖１初分離的新生兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邋圖２培養(yǎng)３天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ邋４００）逡逑■邋■逡逑圖３培養(yǎng)５天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邐圖４培養(yǎng)８天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）逡逑桯暴＿．．＿媝逡逑圖５培養(yǎng)１１天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邋圖Ｇ培養(yǎng)１５天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）逡逑１３逡逑

體積增大，部分細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞三五成群連接生長（圖２）。５ｄ后，長逡逑出許多新生細(xì)胞，逐漸成鋪路石狀成片生長（圖３）；邋８ｄ后，細(xì)胞開始有老化現(xiàn)象，并逡逑有死細(xì)胞出現(xiàn)（圖４）；邋ｌＴｌ５ｄ，細(xì)胞出現(xiàn)黑色顆粒狀物質(zhì)和空泡，逐漸死亡脫落（圖５，逡逑圖６）。逡逑■邋■逡逑圖１初分離的新生兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邋圖２培養(yǎng)３天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ邋４００）逡逑■邋■逡逑圖３培養(yǎng)５天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邐圖４培養(yǎng)８天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）逡逑桯暴＿．．＿媝逡逑圖５培養(yǎng)１１天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）邋圖Ｇ培養(yǎng)１５天的兔原代肝細(xì)胞（Ｘ４００）逡逑１３逡逑

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