【摘要】：研究背景非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是與肥胖密切相關(guān)的慢性代謝性肝病之一。隨著肥胖、2型糖尿病發(fā)病率的顯著增加,NAFLD已成為全球的主要肝臟疾病。依據(jù)臨床和病理特征,NAFLD包括單純性脂肪變性(Non-alcoholic fatty liver,NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)兩個亞型。與NAFL相比,NASH患者進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病的風(fēng)險顯著增加。但目前NASH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,尚無針對NASH的有效藥物。肝臟炎癥是NASH的典型組織病理學(xué)特征之一。臨床和動物實(shí)驗(yàn)均證實(shí),肝臟中性粒細(xì)胞浸潤增加是NASH的典型組織病理學(xué)特征之一,但介導(dǎo)NASH狀態(tài)下中性粒細(xì)胞肝臟浸潤的分子機(jī)制不清楚。Micro RNA-223(miR-223)是高度保守且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的內(nèi)源性非編碼RNA,在髓系細(xì)胞中具有高豐度。臨床研究揭示,miR-223的肝臟表達(dá)水平在NAFL和NASH組具有顯著差異。研究miR-223調(diào)控中性粒細(xì)胞炎性炎性、介導(dǎo)肝臟炎癥的病理生理學(xué)功能對于深入揭示NASH發(fā)生、進(jìn)展的分子機(jī)制具有重要科學(xué)意義。研究目的1.利用三種不同方案誘導(dǎo)NASH小鼠模型,分別評價肝臟組織病理學(xué)特征和代謝表型,為研究NASH相關(guān)目標(biāo)基因的病理生理學(xué)功能建立動物模型基礎(chǔ)2.闡明miR-223在NASH小鼠模型中的組織表達(dá)譜3.通過基因功能缺失(loss-of-function)策略,研究miR-223在肝臟代謝性炎癥和NASH疾病進(jìn)展的病理生理學(xué)功能4.揭示miR-223調(diào)控NASH條件下介導(dǎo)肝組織炎癥的天然免疫細(xì)胞的炎性反應(yīng)的分子機(jī)理基于以上研究目的,本課題的總體研究目標(biāo)旨在為以miR-223為潛在靶點(diǎn)研發(fā)防治NASH的新型藥物(包括創(chuàng)新中藥)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)支持。研究策略和方法1.在miR-223基因表達(dá)譜的研究中利用實(shí)時熒光定量PCR(q PCR)的方法檢測標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂的C57 BL/6J野生型小鼠各器官/組織miR-223的表達(dá)水平。2.利用三種方法誘導(dǎo)NASH小鼠模型:(1)10周齡C57 BL/6J野生型雄性小鼠以蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飲食飼喂5周誘導(dǎo)NASH、同時以蛋氨酸-膽堿充足(MCS)作為對照飲食;(2)4周齡C57 BL/6J野生型雄性小鼠以高脂高膽固醇(HFHC)飲食飼喂20周聯(lián)合單次腹腔脂多糖(LPS)注射誘導(dǎo)NASH;(3)Apo E敲除雄性小鼠以HFHC飲食飼喂20周誘導(dǎo)NASH,均以標(biāo)準(zhǔn)飲食(SC)為對照飲食。運(yùn)用HE、Masson染色方法及AST血清生化指標(biāo)檢測方法評價NASH組織病理學(xué)特征和肝細(xì)胞損傷水平;采用體重監(jiān)測、血糖試紙檢測空腹血糖、葡萄糖耐量、血清TG、TC水平檢測等方法鑒定小鼠脂質(zhì)代謝及系統(tǒng)性代謝表型。3.為研究miR-223在NASH發(fā)生和進(jìn)展中的病理生理學(xué)功能,本課題采用基因功能缺失(loss-of-function)研究策略,將周齡匹配的雄性miR-223敲除(miR-223 knockout,miR-223 KO)和野生型(wild type,WT)對照小鼠分別按上述三種方案誘導(dǎo)NASH模型,并利用上述實(shí)驗(yàn)方法評價NASH組織病理學(xué)特征、脂質(zhì)代謝及系統(tǒng)性代謝表型。運(yùn)用q PCR的方法檢測MCD、HFHC+LPS誘導(dǎo)模型中C57 BL/6J野生型小鼠肝臟miR-223表達(dá)。4.在miR-223調(diào)控NASH誘發(fā)的天然免疫細(xì)胞肝臟浸潤和炎癥反應(yīng)的功能研究中,運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法檢測三種模型巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞在肝臟的浸潤以及中性粒細(xì)胞顆粒蛋白MPO、PR3、NE和LCN2在肝臟的表達(dá)。運(yùn)用蛋白印跡的方法檢測肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的MPO、LCN2蛋白表達(dá)水平。5.在miR-223干預(yù)中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)的分子機(jī)制研究中,運(yùn)用q PCR的方法比較miR-223 KO和C57 BL/6J野生型小鼠中性粒細(xì)胞及骨髓細(xì)胞顆粒蛋白的表達(dá)水平;分別分離miR-223敲除和野生型對照小鼠的原代中性粒細(xì)胞,運(yùn)用Transwell方法比較中性粒細(xì)胞遷移能力。結(jié)果1.MiR-223基因表達(dá)譜研究于標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂的C57 BL/6J野生型小鼠中進(jìn)行的系統(tǒng)性基因表達(dá)譜研究結(jié)果顯示,miR-223在骨髓細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中的豐度較其他器官/組織顯著升高,呈現(xiàn)明顯的髓系細(xì)胞特異性;2.以NASH的關(guān)鍵臨床表現(xiàn)和主要組織病理學(xué)特征評價三種小鼠NASH模型1)蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飲食誘導(dǎo)模型(MCD模型)表現(xiàn)出與人類NASH相似的典型肝臟組織病理學(xué)特征,包括肝細(xì)胞脂肪變性、肝組織炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變;該模型的部分系統(tǒng)性代謝表型與人類NASH不符,包括體重下降、胰島素敏感性升高、不伴高脂血癥;2)高脂高膽固醇(HFHC)飲食聯(lián)合單次腹腔脂多糖(LPS)注射模型(HFHC+LPS模型)具有與人類NASH相似的部分肝臟組織病理學(xué)特征,包括肝細(xì)胞脂肪變性、一過性肝組織炎癥,無明顯肝細(xì)胞氣球樣變和肝纖維化;伴有顯著的糖脂代謝紊亂表型,包括體重增加、葡萄糖耐量受損和血脂異常;3)HFHC飲食飼喂Apo E敲除小鼠模型(Apo E模型)具有與人類NASH相似的部分肝臟組織病理學(xué)特征,包括肝細(xì)胞脂肪變性、肝組織炎癥(輕-中度),無明顯肝細(xì)胞氣球樣變;伴有顯著的糖脂代謝紊亂表型,包括體重增加、葡萄糖耐量受損、血脂異常。3.MiR-223在NASH發(fā)生中的病理生理功能研究結(jié)果1)三種NASH模型誘導(dǎo)方案下表型鑒定結(jié)果一致顯示,miR-223 KO小鼠肝臟炎癥和肝細(xì)胞損傷較野生型對照組顯著加重。MiR-223 KO組的肝組織病理學(xué)特征(包括肝臟炎癥、氣球樣變、組織病理學(xué)CRN評分)較野生型對照組顯著升高、外周血肝功能生化指標(biāo)AST活性增加(n=6-7/組,P0.05)。上述結(jié)果說明miR-223 KO小鼠對于飲食誘導(dǎo)NASH易感性顯著增強(qiáng),說明miR-223缺失顯著加重小鼠的實(shí)驗(yàn)性NASH。2)MiR-223 KO組和野生型對照組比較,肝臟脂類代謝和系統(tǒng)性代謝表型無明顯差異。代謝表型鑒定數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,HFHC+LPS模型,miR-223 KO組和野生型對照組空腹血糖和葡萄糖耐量沒有顯著性差異。Apo E模型,miR-223和Apo E雙敲除組和Apo E敲除對照組體重,血清生化指標(biāo)TG、TC水平無顯著性差異。MCD模型,miR-223 KO組和野生型對照組體重、血清生化指標(biāo)TG、TC水平無顯著性差異。說明miR-223缺失對肝臟脂質(zhì)代謝和系統(tǒng)性代謝表型無明顯影響。4.MiR-223調(diào)控NASH誘發(fā)的天然免疫細(xì)胞肝臟浸潤和炎癥反應(yīng)的功能研究1)通過免疫組織化學(xué)法檢測肝組織巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80及中性粒細(xì)胞標(biāo)記物,結(jié)果顯示,在MCD飲食誘發(fā)的巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞肝臟浸潤水平在miR-223 KO組較野生型對照組顯著增加。2)MCD模型,免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞顆粒蛋白MPO、PR3、NE及LCN2表達(dá)水平在MCD飲食飼喂miR-223 KO組中較野生型對照組顯著增加。3)HFHC+LPS模型,免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞顆粒蛋白MPO、PR3、NE及LCN2表達(dá)水平在HFHC飲食飼喂miR-223 KO組中較野生型對照組顯著增加。4)Apo E模型,免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞顆粒蛋白MPO、PR3及LCN2表達(dá)水平在HFHC飲食飼喂miR-223 KO組中較野生型對照組顯著增加。5)MCD模型和HFHC+LPS模型,蛋白印跡檢測結(jié)果顯示在NASH條件下,miR-223 KO組小鼠肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞MPO、LCN2表達(dá)水平顯著增加。5.MiR-223干預(yù)中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)的分子機(jī)制研究1)通過q PCR方法檢測m RNA水平,結(jié)果顯示:MPO、LCN2表達(dá)水平在miR-223 KO小鼠中性粒細(xì)胞中較野生型對照小鼠顯著性增加。2)核酸檢測(q PCR)結(jié)果顯示MPO、PR3、NE及LCN2表達(dá)水平在miR-223 KO小鼠骨髓細(xì)胞較野生型對照小鼠顯著增加。3)中性粒細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示:miR-223 KO小鼠中性粒細(xì)胞遷移功能較野生型對照小鼠顯著增強(qiáng)。結(jié)論1.分別以臨床肝臟組織病理學(xué)特征和其相關(guān)的代謝異常為核心評價指標(biāo),本課題中誘導(dǎo)的三種NASH小鼠模型(MCD、HFHC+LPS、Apo E)均表現(xiàn)出不同程度的臨床NASH關(guān)鍵組織病理學(xué)特征和特定代謝表型。綜合分析,三種模型分別具有特征和局限;因此,在研究NASH相關(guān)基因功能或新型藥物臨床前評價時,應(yīng)依據(jù)研究目的和重點(diǎn)關(guān)注的NASH特征進(jìn)行選擇單一模型或組合應(yīng)用。2.MiR-223缺失顯著加重飲食誘導(dǎo)的肝組織代謝性炎癥、顯著增加實(shí)驗(yàn)性小鼠對于NASH的易感性。3.MiR-223缺失顯著增加實(shí)驗(yàn)性NASH模型肝組織中巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞的浸潤。4.MiR-223缺失顯著增加中性粒細(xì)胞顆粒蛋白MPO、PR3、NE及LCN2的m RNA表達(dá)和蛋白豐度。5.MiR-223缺失顯著增強(qiáng)中性粒細(xì)胞遷移能力。綜上所述,本課題研究結(jié)果揭示出:MiR-223可通過抑制中性粒細(xì)胞中多個顆粒蛋白的表達(dá)而抑制中性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng),顯著阻斷中性粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞對話,減緩肝組織代謝性炎癥和其誘發(fā)的肝細(xì)胞損傷,改善小鼠NASH。因此,miR-223及其調(diào)控的中性粒細(xì)胞顆粒蛋白是研發(fā)NASH新藥(包括創(chuàng)新中藥)的新型潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.5
【圖文】：

研究假設(shè)

總技術(shù)路線

37圖 3-1 MCD飲食飼喂小鼠具有 NASH 典型組織病理學(xué)特征/6J 雄性小鼠分別以 MCD飲食或 MCS 飲食飼喂 5周。（A）肝組織100 μm）（B）肝組織 Masson 染色（上標(biāo)尺，100 μm）。（C）N統(tǒng)的 NAS 評分半定量 NASH 程度。（D）血清 AST 水平。實(shí)驗(yàn)數(shù) SD表示，n = 5-8. *P < 0.05, *** P < 0.001.

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本文編號：2775308