【摘要】：背景和目的:異常的O-Glc NAc糖基化修飾與炎癥相關(guān)性疾病關(guān)系密切。在OGA腸上皮特異敲除(OGA intestine-specific knockout,OGA-IKO)小鼠模型的基礎(chǔ)上探討OGA對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)的作用及機(jī)制。方法:1.潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)患者樣本收集:尊重患者意愿并簽署知情同意書(shū),在結(jié)腸鏡下用活檢鉗鉗取潰瘍和遠(yuǎn)離病灶的正常黏膜組織各2-3塊。采用Western Blot和免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)的方法觀察OGA、OGT和O-Glc NAc蛋白在UC和正常結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)情況。2.利用Cre/Lox P重組酶系統(tǒng),將OGA-Flox小鼠和OGA-Kin小鼠分別與VilinCre工具小鼠進(jìn)行交配以構(gòu)建OGA-IKO和OGA-IKI小鼠模型。3.采用葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium,DSS)溶液自由飲水的方法對(duì)8-10周齡小鼠進(jìn)行結(jié)腸炎誘導(dǎo),觀察OGA-IKO小鼠和同窩對(duì)照OGA-Flox小鼠的結(jié)腸炎表型,通過(guò)HE和q RT-PCR結(jié)果評(píng)價(jià)小鼠結(jié)腸組織損傷和炎癥程度。4.采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系(NCM460)中構(gòu)建OGA敲減和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。5.采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察OGA敲減后對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響;在透射電鏡下觀察OGA敲減后對(duì)NCM460細(xì)胞系和小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響;探討OGA敲減后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的變化及其參與結(jié)腸炎癥的潛在機(jī)制。6.基于16S r DNA測(cè)序技術(shù),探究OGA腸上皮特異敲除對(duì)小鼠腸道菌群多樣性和主要物種豐度的影響,并分析OGA腸上皮特異敲除通過(guò)改變腸道菌群影響UC的潛在機(jī)制。結(jié)果:1.相對(duì)于正常結(jié)腸黏膜,潰瘍性結(jié)腸炎黏膜組織中OGA、O-Glc NAc和OGT蛋白的表達(dá)水平均明顯升高。2.成功構(gòu)建了OGA-IKO和OGA-IKI小鼠模型。Western Blot驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在OGAIKO小鼠腸道組織中OGA表達(dá)水平明顯降低,總體O-Glc NAc水平升高,同時(shí)OGT表達(dá)水平代償性降低;在OGA-IKI小鼠腸道組織中OGA表達(dá)水平升高,但未觀察到O-Glc NAc和OGT水平有明顯改變。同樣通過(guò)免疫組化的方法也分別觀察到OGA表達(dá)水平的降低和升高。3.對(duì)小鼠進(jìn)行結(jié)腸炎誘導(dǎo)后,觀察發(fā)現(xiàn)OGA-IKO小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的敏感性降低。與OGA-Flox小鼠相比,OGA-IKO小鼠體重下降比例、炎癥活動(dòng)指數(shù)及結(jié)腸縮短程度均低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DSS造模小鼠結(jié)腸的HE染色結(jié)果顯示:相對(duì)于野生對(duì)照小鼠,OGA-IKO小鼠結(jié)腸上皮損傷程度較輕,結(jié)腸黏膜破壞范圍較小,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也相對(duì)不明顯。q RT-PCR檢測(cè)小鼠結(jié)腸樣本,結(jié)果顯示:OGA-IKO組小鼠炎癥因子TNFα、IL-6和IL-1β表達(dá)水平均低于對(duì)照組,提示結(jié)腸上皮中OGA的缺失在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中發(fā)揮保護(hù)作用。4.成功構(gòu)建了OGA敲減和過(guò)表達(dá)的NCM460細(xì)胞系。OGA敲減和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中OGA、OGT和O-Glc NAc變化與OGA-IKO和OGA-IKI結(jié)果一致,即:OGA敲減后細(xì)胞系中OGA表達(dá)水平降低,總體O-Glc NAc水平升高,OGT表達(dá)水平代償性下降;在OGA過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中OGA表達(dá)升高明顯,同樣未觀察到O-Glc NAc和OGT的蛋白水平發(fā)生明顯改變。5.OGA敲減后細(xì)胞凋亡比例明顯增加,細(xì)胞周期未發(fā)生明顯變化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生明顯,細(xì)胞微絨毛形態(tài)和長(zhǎng)度、細(xì)胞間連接,線(xiàn)粒體、細(xì)胞核等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER Stress)相關(guān)蛋白PERK和Calnexin的表達(dá)水平下降,而CHOP蛋白表達(dá)水平升高。提示OGA缺失可能通過(guò)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能從而參與調(diào)控結(jié)腸的炎癥反應(yīng)。6.通過(guò)對(duì)12周齡的OGA-IKO和OGA-Flox小鼠進(jìn)行腸道菌群16S r DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)OGA-IKO小鼠的菌群多樣性增加,菌群的構(gòu)成也發(fā)生了明顯改變,已知有抑制炎癥作用的毛螺菌(Lachnospiraceae)豐度顯著增加,與炎癥正相關(guān)的細(xì)菌韋榮球菌(Veillonellaceae)和Negativicute豐度顯著下降。提示OGA腸上皮缺失通過(guò)改變菌群結(jié)構(gòu)抑制腸道炎癥。結(jié)論:腸上皮OGA特異敲除在結(jié)腸炎中發(fā)揮保護(hù)作用。小鼠腸上皮OGA特異敲除能減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OGA缺失可能通過(guò)促進(jìn)損傷細(xì)胞的凋亡、影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和改變小鼠腸道菌群譜來(lái)參與結(jié)腸炎癥反應(yīng)。同時(shí)在臨床樣本中也證實(shí)了OGA、OGT和O-Glc NAc的蛋白表達(dá)水平與潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)系密切,這些發(fā)現(xiàn)為尋找治療潰瘍性結(jié)腸炎的靶點(diǎn)提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R574.62
【圖文】：

OGT 和 O-GlcNAc 在結(jié)腸不同部位的lcNAc 修飾被稱(chēng)為能量的 “感受器”， 修飾的異常與代謝綜合征的發(fā)生關(guān)系合征均與低程度的炎癥反應(yīng)密不可分炎癥因子的異常激活。近年來(lái)對(duì) O-G

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文2.1.2 OGA 腸上皮特異敲除小鼠的構(gòu)建1）Ogaflox-Neo/+小鼠去除 Neo cassette獲得條件性基因敲除小鼠帶有正篩選標(biāo)記 Neo cassette，Neo cassette 帶有 polyA信號(hào)，因而得不到全長(zhǎng) mRNA。所以首先要在 F1 代小鼠中去掉 Neo cassette。Flp重組酶可以特異識(shí)別 Neo cassette 的 Frt 序列。將 F1 小鼠與帶有 Flp-deleter 的小鼠進(jìn)行交配，即得到帶有 Flp 基因的 floxed（fl）小鼠（Flp-Floxed 小鼠）。具體策略如下圖 4

圖 5 Ogafl/fl小鼠與 Villin-Cre 鼠交配獲得 OGA 腸道特異敲除小鼠策略。 A：交配策略；B:瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型結(jié)果。2.1.3 OGA 腸上皮過(guò)表達(dá)小鼠的構(gòu)建OGA 過(guò)表達(dá)的策略同樣利用 Cre/Loxp 系統(tǒng)，利用基因和胚胎工程在 OGA 基因轉(zhuǎn)錄的終止子敲入突變（Kin）轉(zhuǎn)錄終止子失活，mRNA持續(xù)轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn) OGA過(guò)表達(dá)，根據(jù)其過(guò)表達(dá)的原理，DNA一條鏈帶有 Kin位點(diǎn) OgaKin+即可達(dá)到過(guò)表達(dá)目的,將 OgaKin+于同一背景的 Villin-Cre鼠交配獲得 OgaKin+，Cre+小鼠即為 OGA腸上皮特異過(guò)表達(dá)小鼠。2.2 小鼠瓊脂糖電泳基因型鑒定2.2.1 鼠尾 DNA 提取1）將 3 周齡的小鼠按性別分籠并剪尾，剪尾長(zhǎng)度約 0.2-0.3CM，置于 1.5ml EP管中。2）每個(gè) EP 管中加入 100ul 的 Buffer L 溶液和 2ul 的 Protease，離心混勻并保證

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9 王s

本文編號(hào)：2775230