【摘要】：肝纖維化是包括肝硬化、病毒性肝病、酒精性肝病等慢性肝病發(fā)展過程中所共有的階段,腸道微生物及其代謝物與肝纖維化進程有一定相關(guān)性。脫硫弧菌是硫酸鹽還原菌在生物體內(nèi)的重要成員之一,與腸道炎癥等疾病密切相關(guān)。短鏈脂肪酸是腸道微生物的重要代謝產(chǎn)物,具有許多生理作用。本論文研究了脫硫弧菌對正常小鼠、CCl_4誘導肝纖維化小鼠的肝纖維化發(fā)展及其腸道短鏈脂肪酸合成的影響,主要工作如下:(1)建立了UPLC測量糞便樣品中短鏈脂肪酸含量的方法。首先對腸道中可能存在的短鏈脂肪酸種類進行調(diào)研,對11種報道過的短鏈脂肪酸進行了全波長掃描,流動相優(yōu)化,柱溫優(yōu)化,流速及洗脫程序優(yōu)化和內(nèi)標選擇。并對所建方法的線性、保留時間、檢測限、定量限、回歸方程、準確度及精密度等指標進行了方法學驗證。將所建立方法與常用氣相色譜法進行對比,結(jié)果顯示此方法能在10分鐘內(nèi)快速分離11種短鏈脂肪酸,其加標回收率為98.15-106.07%,精密度為0.58-7.33%,并有良好的線性,可用于糞便中短鏈脂肪酸的檢測。新建立的UPLC法單次分析時間短,可檢測短鏈脂肪酸數(shù)量多,更適合于糞便樣品的檢測。(2)肝纖維化模型動物腸道中脫硫弧菌的差異性分析。通過對CCl_4誘導的肝纖維化小鼠糞便脫硫弧菌含量檢測發(fā)現(xiàn),造模10周的小鼠與未造模小鼠脫硫弧菌含量相比增高近19倍(p0.01),提示脫硫弧菌在腸道中過量增殖與肝纖維化存在一定相關(guān)性。(3)將脫硫弧菌標準菌液(NC+ATCC 29577組)及富集菌液(NC+Df-enrichment組)灌胃正常小鼠,通過qRT-PCR法確認了外源脫硫弧菌可引起正常小鼠體內(nèi)脫硫弧菌的增加(~(***)p0.001)。對小鼠肝指數(shù)、組織切片天狼猩紅染色等表觀指標評價表明,與對照組(NC+PBS組)相比,NC+ATCC 29577組及NC+Df-enrichment組肝指數(shù)分別增高26.3%及30.5%(~*p0.05),實驗組小鼠肝組織血管附近均出現(xiàn)顯著的膠原蛋白沉積,膠原蛋白前體物質(zhì)羥脯氨酸分別升高了64.7%及49.4%(~(**)p0.01)。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定結(jié)果表明,實驗組小鼠肝組織損傷均顯著性增加(p0.05)。兩實驗組小鼠α-SMA基因表達分別增高270.4%及303%(~(***)p0.001),Col1基因表達分別增高近17倍及23倍(~(**)p0.01,~(***)p0.001)。上述結(jié)果表明正常小鼠在灌胃外源脫硫弧菌一段時間后,均出現(xiàn)了肝纖維化。對CCl_4誘導的肝纖維化小鼠灌胃標準菌液(CCl_4+ATCC 29577)及富集菌液(CCl_4+Df-enrichment),僅CCl_4+ATCC29577組小鼠腸道脫硫弧菌含量較模型組(CCl_4+PBS)增加28.87%(p0.05)。兩組小鼠肝指數(shù)、肝臟羥脯氨酸、肝纖維化相關(guān)基因α-SMA及Col1與CCl_4+PBS組相比無明顯差異。與CCl_4+PBS組相比,CCl_4+ATCC 29577組ALT、AST顯著性增加(p0.05),而CCl_4+Df-enrichment組AST水平也有顯著性增高(p0.05)。采用滅活菌液探究小鼠脫硫弧菌含量,結(jié)果顯示滅活菌液并無法引起正常小鼠糞便脫硫弧菌含量的增加(p0.05),其肝指數(shù)、肝臟羥脯氨酸含量等檢測結(jié)果也表明該組小鼠沒出現(xiàn)肝纖維化現(xiàn)象。(4)CCl_4+ATCC 29577及CCl_4+Df-enrichment小鼠肝組織中硫化氫含量較NC+PBS組出現(xiàn)顯著性下降(~(***)p0.001),而在血清中硫化氫含量較NC+PBS組相比增加26.2%及21.2%(~(**)p0.01,~(***)p0.001)。肝臟硫化氫合成相關(guān)基因表達結(jié)果表明灌胃脫硫弧菌可上調(diào)CSE表達并下調(diào)CBS基因表達,趨勢與CCl_4造模后相同,表明脫硫弧菌可能是通過影響機體中硫化氫代謝進而影響肝臟纖維化,而糞便中硫化氫含量與血清出現(xiàn)相同的升高。對糞便樣品SCFAs含量進行分析,CCl_4+ATCC 29577及CCl_4+Df-enrichment組的乙酸含量較CCl_4+PBS提升近16%(~#p0.05),表明脫硫弧菌對乙酸代謝相關(guān)菌群影響較大。此外CCl_4+Df-enrichment組在丁酸及戊酸含量較CCl_4+PBS組亦有顯著性增加(~#p0.05),表明脫硫弧菌富集菌液對丁酸及戊酸相關(guān)代謝菌群有一定關(guān)聯(lián)。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575
【圖文】：

第一章 緒論SRB 可通過氧化還原作用利用硫酸鹽產(chǎn)生 H2S 進入血液中發(fā)揮其生理作用。肝臟是硫化氫合成的重要部位之一，合成途徑如圖 1-1 所示。H2S 是生物體內(nèi)重要的氣體分子，已被證明與心血管系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)有密切的關(guān)聯(lián)，它可舒張血管平滑肌，降低血壓，有效保護心血管[46]。然而，當體內(nèi) H2S 濃度累積到一定濃度時，可能抑制丁酸鹽氧化，引發(fā)細胞凋亡[47]。小鼠體內(nèi)的硫化氫代謝主要通過 SRB 將腸道中血紅素類化合物轉(zhuǎn)化為

江南大學碩士論文SCFAs 在腸道中的濃度并不完全相同，以盲腸與近結(jié)腸段最高[54]。膳食纖維在內(nèi)的微生物轉(zhuǎn)化結(jié)果合成了三種主要的 SCFAs：醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽。乙酸鹽丙酮酸通過乙酰 Co-A 生成的，也可以通過 Wood-Ljungdahl 通路產(chǎn)生。丁酸是由兩子的乙酰輔酶 a 合成的，產(chǎn)生乙酰乙酰 Co-A，通過 β-羥基丁基 Co-A 和巴豆�；� C進一步轉(zhuǎn)化為丁基 Co-A。丙酸鹽可由 PEP 通過琥珀酸途徑或丙烯酸酯途徑形成，乳被還原為丙酸酯。微生物也可以通過丙二醇途徑從脫氧己糖（如海藻糖和鼠李糖）生丙酸[56]。

20流動相對短鏈脂肪酸分離色譜圖（a）10 mM H2SO4（b）乙腈-NaH2PO-NaH2PO4hromatograms of different mobile phase for analysis of SFCAs (a) 10 mM HAcetonitrile- NaH2PO4(c) Methanol- NaH2PO4注：1.甲酸，2.乙酸，3.丙酸，4.丁酸確定結(jié)果標物質(zhì)的保留時間及與各分析物分析效果分析，草酸、檸檬酸min 內(nèi)，與待測的甲酸、乙酸分離效果較差，通過改變流速及分離效果。而 2-乙基丁酸出峰時間介于正戊酸及 3-甲基戊酸之的分離效果，適合用于內(nèi)標物質(zhì)。各內(nèi)標物保留時間隨流速變

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