【摘要】：背景和目的盡管已有研究報(bào)道“多次打擊”參與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)生和進(jìn)展,但NAFLD進(jìn)展至非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的相關(guān)機(jī)制目前尚未完全清楚。近年來(lái),越來(lái)越多研究將腸道微生物,腸道屏障完整性和NAFLD聯(lián)系起來(lái)。臨床資料顯示,腸道炎癥常與肝臟損傷有關(guān),如炎癥性腸病(IBD)常伴有NAFLD。腸道菌群失調(diào)可引起腸道炎癥和腸道屏障損傷,隨后腸道細(xì)菌及其產(chǎn)物和有毒物質(zhì)及炎癥介質(zhì)的易位可促進(jìn)肝臟損傷,故腸道屏障功能障礙在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。因此,在NAFLD/NASH的發(fā)展過(guò)程中,腸道屏障破壞是腸肝軸的炎癥轉(zhuǎn)運(yùn)和肝臟免疫持續(xù)激活的重要機(jī)制。眾所周知,腸道黏膜屏障起到了阻止腸道微生物侵入的第一道防線作用。最新的研究發(fā)現(xiàn),除了腸道黏膜屏障之外,還存在抵抗腸道微生物的第二道防線-腸血管屏障(GVB)。GVB可以控制外來(lái)抗原進(jìn)入體內(nèi),防止腸道細(xì)菌易位及其全身播散。而且,研究證實(shí)腸道血管屏障(GVB)損傷可能是導(dǎo)致乳糜瀉患者肝臟損傷的重要原因。然而,目前還沒(méi)有臨床和實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)GVB在NAFLD/NASH中功能。本研究通過(guò)建立伴有腸道炎癥損傷的NAFLD模型,研究腸道炎癥對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型肝臟損傷的影響,并明確腸道炎癥加重肝臟損傷的機(jī)制;同時(shí)觀察腸道屏障損傷和腸道菌群移位情況,并進(jìn)一步證明GVB功能障礙及腸肝軸異常在NAFLD進(jìn)展中的作用。方法1.通過(guò)喂食C57BL/6小鼠葡聚糖硫酸鈉(DSS)和高脂飲食(HFD)12周,建立腸道炎癥損傷的NAFLD模型,隨機(jī)分為四組:正常飲食組(Con),高脂飲食組(HFD),DSS組和HFD+DSS組。通過(guò)疾病活動(dòng)度評(píng)分(DAI)、結(jié)腸形態(tài)學(xué)變化和結(jié)腸組織活動(dòng)度評(píng)分(HAI)來(lái)評(píng)估結(jié)腸炎癥損傷情況,并用RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)腸組織炎癥因子IL-1和TNF-α的mRNA表達(dá)。應(yīng)用油紅O染色觀察小鼠肝臟脂肪變性程度,HE染色觀察小鼠肝臟組織病理?yè)p傷情況,同時(shí)Masson染色觀察小鼠肝臟纖維化病變情況。RT-PCR方法檢測(cè)各組小鼠肝組織中的炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1的表達(dá)情況以及促纖維化因子Collagen 1、ACTA2、TGF-β、PAI-1和TIMP-1的表達(dá)情況。Western blot方法檢測(cè)小鼠肝臟組織中Collagen 1蛋白的表達(dá)情況。2.通過(guò)終點(diǎn)顯色法鱟試劑檢測(cè)了各組小鼠門靜脈內(nèi)毒素的含量,此外用RT-PCR方法檢測(cè)各組小鼠肝臟中模式識(shí)別受體TLR-4和TLR-9的表達(dá)情況。Western blot方法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸黏膜緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和Claudin 1的表達(dá)情況。為了評(píng)估腸道血管屏障通透性,我們將2mg FITC-dextran 70KD(FD70)注射入小鼠結(jié)腸袢中,通過(guò)熒光顯微鏡觀察肝臟和脾臟中FD70熒光素的分布情況和同時(shí)用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定血清中FD70熒光素的含量。另外,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)腸血管屏障通透性指標(biāo)質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白PV 1的表達(dá)情況,并用免疫熒光共聚焦方法進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)腸組織PV-1的表達(dá)和分布情況。結(jié)果1.與對(duì)照組相比,DSS組和HFD+DSS組小鼠體重明顯降低,DAI評(píng)分顯著增加,結(jié)腸明顯縮短,結(jié)腸黏膜損傷(隱窩和杯狀細(xì)胞減少、隱窩扭曲、黏膜下水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn))及組織病理評(píng)分顯著增加。此外,PCR檢測(cè)顯示DSS組和HFD+DSS組結(jié)腸中促炎癥因子IL-1、TNF-α表達(dá)顯著升高。油紅O染色顯示HFD組肝臟出現(xiàn)明顯的脂滴,而HFD+DSS組肝臟內(nèi)脂滴沉積更為明顯。HE肝臟組織學(xué)檢測(cè)顯示,HFD組和HFD+DSS組肝臟結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)大量的脂肪空泡,而且HFD+DSS組肝臟還伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與肝臟組織病理結(jié)果一致,HFD+DSS組肝臟促炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表達(dá)顯著增加。Masson染色顯示HFD+DSS組肝臟出現(xiàn)少許纖維組織沉積。與HFD組相比,HFD+DSS組肝臟中Collagen I蛋白的表達(dá)增加。而且,HFD+DSS組小鼠肝臟促纖維化因子Collagen 1、ACTA2、TGF-β、PAI-1和TIMP-1 mRNA的表達(dá)也增加,且明顯高于HFD組。另外,Spearman相關(guān)性分析表明,模型小鼠DAI評(píng)分和HAI評(píng)分與小鼠肝臟病變嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)(r=0.813,P0.01;r=0.930,P0.01)。2.通過(guò)內(nèi)毒素鱟試劑檢測(cè)門靜脈血漿內(nèi)毒素水平,結(jié)果顯示HFD+DSS組門靜脈內(nèi)毒素水平較HFD組和DSS組具有升高的趨勢(shì),但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR結(jié)果顯示,HFD+DSS組肝臟中TLR4和TLR9的表達(dá)明顯高于其他三組。Western Blot檢測(cè)顯示,DSS組和HFD+DSS組結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Claudin1的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少。腸血管屏障通透性檢測(cè)結(jié)果顯示,HFD+DSS組肝臟脾臟內(nèi)FD70的熒光密度較HFD組和DSS組顯著增加,且HFD+DSS組血清中FD70熒光素的含量較對(duì)照組也明顯增加。Western blot檢測(cè)顯示,相比于正常組和HFD組,DSS組和HFD+DSS組結(jié)腸中PV-1蛋白的表達(dá)明顯升高。免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示,DSS組和HFD+DSS組結(jié)腸中PV-1的表達(dá)增加,而且HFD+DSS組結(jié)腸中PV-1的表達(dá)增加較HFD組更明顯,這與western blot結(jié)果相一致。另外,PV-1(紅色熒光標(biāo)記)與血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31(綠色熒光標(biāo)記)的表達(dá)位置有重疊,表明PV-1蛋白定位于腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞。Spearman相關(guān)性分析表明,模型小鼠結(jié)腸PV-1蛋白水平與小鼠肝臟病變嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)(r=0.868,P0.01)。結(jié)論腸道炎癥加重高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠肝臟炎癥和纖維化損傷,并促進(jìn)NASH發(fā)生。除了受損的腸道黏膜屏障外,腸血管屏障破壞和菌群移位或內(nèi)毒素血癥可能在NASH的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。更重要的是,本研究證實(shí)了GVB在NASH發(fā)病機(jī)制中的重要作用,并進(jìn)一步突出了飲食因素、腸道屏障和腸道微生物在推動(dòng)NAFLD進(jìn)展過(guò)程中的復(fù)雜作用。了解腸道血管屏障可能為腸-肝軸的調(diào)節(jié)提供新的見解,從而為預(yù)防和治療NASH提供潛在的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575.1
【圖文】：

TEMED 4ul2.動(dòng)物模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組SPF 級(jí) C57BL/6 小鼠 40 只隨機(jī)分為四組，每組 10 只，分別為正常組、HFD 組、DSS 組和 HFD+DSS 組。正常組小鼠進(jìn)食普通飼料和飲用蒸餾水；高脂飲食組小鼠進(jìn)食含 60%脂肪供能的 D12492 高脂飼料和飲用蒸餾水；DSS 組小鼠進(jìn)食普通飼料和飲用含 1% DSS的蒸餾水；HFD+DSS 組小鼠進(jìn)食含 60%脂肪供能的 D12492 高脂飼料和飲用含 1% DSS的蒸餾水。四組小鼠共飼養(yǎng) 12 周，其中 DSS 組和 HFD+DSS 組小鼠，先飲用 1% DSS 溶液 7 天，然后改為飲用正常水 10 天，此為 個(gè)周期，共進(jìn)行五個(gè)周期；正常組和高脂飲食組小鼠同樣飲用相應(yīng)天數(shù)的蒸餾水，建模示意圖見圖 1。12 周后隔夜進(jìn)食，次日給與 1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，取出肝臟和結(jié)腸組織，檢測(cè)各組結(jié)腸的長(zhǎng)度，留取部分肝臟和結(jié)腸組織標(biāo)本做相應(yīng)的檢測(cè)，余下的標(biāo)本放入-80℃的低溫冰箱中保存。

隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠體重稍微增加但小鼠體重總體趨勢(shì)下降(見圖2)。1.2 模型小鼠結(jié)腸炎癥損傷的評(píng)估1.2.1 模型小鼠體重變化趨勢(shì)在實(shí)驗(yàn)期間，我們檢測(cè)各組小鼠每周的體重變化，并計(jì)算小鼠每周體重占初始體重的百分比（圖 2）。正常組小鼠體重緩慢增加，到 12 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)較前增加為 121.32%±11.69%；HFD 組小鼠體重隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，到造模結(jié)束時(shí)，小鼠體重較初始體重增加為 139.77%±7.24%。DSS 組小鼠在小鼠體重在前兩周下降，在第二周下降最明顯（97.59%±10.24%），隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，DSS 組體重緩慢增加，至造模結(jié)束時(shí)體重增長(zhǎng)為 109.83%±6.72%；HFD+DSS 組小鼠體重在前三周下降，在第三周下降最明顯（91.08%±11.18%）

型小鼠疾病活動(dòng)度（DAI）的評(píng)分和四組間 DAI 評(píng)分的比較（*P<0.05型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的評(píng)估模結(jié)束后處死小鼠，從四組小鼠中剪取結(jié)腸并進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量。結(jié)果顯結(jié)腸最短（5.59±0.34cm），正常組小鼠結(jié)腸最長(zhǎng)（7.75±0.63cm）相比，HFD+DSS 組和 DSS 組（5.83±0.50cm）小鼠結(jié)腸明顯縮短，義（P<0.01），而HFD組（6.74±0.77cm）結(jié)腸長(zhǎng)度縮短，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意D 組相比，HFD+DSS 組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.，HFD 組結(jié)腸長(zhǎng)度相差不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖 4-5）。

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