發(fā)布時(shí)間：2020-07-23 23:40

【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病,發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。熱激蛋白70(heat shock protein,HSP70)在大多數(shù)生物中含量最多,在應(yīng)激反應(yīng)中最為敏感。肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)在NAFLD中表達(dá)上調(diào),促進(jìn)NAFLD的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)在熱激的情況下,敲低FTO能促進(jìn)HSP70的合成。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察HSP70-FTO軸在NAFLD發(fā)病過程中的作用,期望為NAFLD的防治提供新的思路。本課題通過以下三部分探究了HSP70與FTO之間的關(guān)系,及其在NAFLD中的作用及機(jī)制。一、HSP70和NAFLD之間的關(guān)系目的:探討HSP70在NAFLD人群血清、NAFLD小鼠肝臟以及棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞脂肪變性模型中的表達(dá)水平。方法:ELISA檢測(cè)NAFLD人群血清中HSP70表達(dá)水平的變化;用高脂飼料制備NAFLD小鼠動(dòng)物模型,qPCR、Western blot及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HSP70的表達(dá)及組織學(xué)定位;0.5mM PA作用人肝癌HepG2細(xì)胞24 h誘導(dǎo)脂肪變性模型,qPCR及Western blot檢測(cè)HSP70表達(dá)水平。結(jié)果:NAFLD人群血清中HSP70表達(dá)明顯增加,且與BMI、腰圍、血清ALT之間呈顯著正相關(guān);免疫組化及Western結(jié)果顯示,HSP70在高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟中表達(dá)上調(diào)且入核增多;在HepG2細(xì)胞脂肪變性模型中,HSP70mRNA及蛋白水平在PA作用下表達(dá)顯著增高。結(jié)論:HSP70在NAFLD中表達(dá)上調(diào),可能與NAFLD的發(fā)病過程有密切關(guān)系。二、HSP70對(duì)NAFLD的作用目的:探討HSP70在NAFLD中的功能及作用方法:體外實(shí)驗(yàn):慢病毒轉(zhuǎn)染Lenti-HSPA1A及Lenti-Vector過表達(dá)HSPA1A,油紅O染色判斷細(xì)胞內(nèi)脂滴,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清內(nèi)甘油三酯(TG)及膽固醇(TC)水平,qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪合成相關(guān)酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C、脂肪分解相關(guān)酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平;再給予PA刺激24 h后檢測(cè)上述指標(biāo)變化;慢病毒轉(zhuǎn)染Si-HSPA1A及Si-Vector干擾HSP70,油紅O染色判斷細(xì)胞內(nèi)脂滴,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清內(nèi)甘油三酯(TG)及膽固醇(TC)水平,qPCR檢測(cè)脂肪合成相關(guān)酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C、脂肪分解相關(guān)酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平;再給予PA刺激24 h,檢測(cè)上述指標(biāo)變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):正常飲食小鼠分為兩組:(1)NFD+AAV-CTL組,(2)NFD+AAV-HSPA1A組;高脂喂養(yǎng)小鼠16周后分為兩組:(1)HFD+AAV-shCTL組,(2)HFD+AAV-shHSPA1A/1B組;監(jiān)測(cè)各組小鼠體重,HE及油紅O染色判斷肝臟脂肪變性。結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn):與僅穩(wěn)定表達(dá)空慢病毒載體的細(xì)胞相比,HSP70過表達(dá)略微增加了HepG2細(xì)胞中脂滴的數(shù)量,在0.5mM PA作用24h后HSP70過表達(dá)的細(xì)胞中的脂滴數(shù)量比僅用慢病毒載體表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯增加,而對(duì)照組的細(xì)胞中的脂滴數(shù)量明顯增加。在細(xì)胞中過表達(dá)HSPA1A上清液的TG水平略有增加,而在細(xì)胞中過表達(dá)HSPA1A上清液TC水平顯著增加,過表達(dá)的慢病毒載體的細(xì)胞與對(duì)照組相比,變化不大。在PA處理后,細(xì)胞過表達(dá)HSP70,TC和TG的分泌明顯增加。此外,脂肪合成相關(guān)酶如FAS,SCD,ACC和SREBP1C以及脂肪分解相關(guān)酶如ACOX,CPT-1,和PPARα的mRNA水平用定量PCR進(jìn)行檢測(cè),ACC和SREBP1C的mRNA水平在HSPA1A過表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)顯著增加,無論是否用PA進(jìn)行處理細(xì)胞,PPARα在HSPA1A過表達(dá)細(xì)胞用PA進(jìn)行處理時(shí)表達(dá)下降。當(dāng)HSP70被敲低時(shí),與對(duì)照組與空白轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比,HSP70敲減后HepG2細(xì)胞中的脂滴數(shù)量沒有顯著差異。在PA處理后,HSP70敲減細(xì)胞顯示的脂質(zhì)小滴比對(duì)照組與空載組細(xì)胞的脂滴少。在siHSPA1A轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比,在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清的TG和TC水平明顯降低,無論是否用PA進(jìn)行處理。我們對(duì)與脂肪合成有關(guān)的酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C以及與脂質(zhì)分解相關(guān)酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平用定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。FAS,SCD與ACC在低表達(dá)HSPA1A細(xì)胞中顯著降低。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在PA處理后,FAS,SCD,ACC和SREBP1C的mRNA水平在敲減HSPA1A細(xì)胞中依然很低,另外CPT-1在PA處理后表達(dá)增高。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):正常組的小鼠肝臟HE及油紅O染色切片無明顯病理變化,過表達(dá)HSPA1A組的肝臟切片也基本無明顯變化。小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)16周,行鼠尾靜脈注射AAV介導(dǎo)的同時(shí)干擾HSPA1A/B載體,在3周后病毒達(dá)到作用高峰,取肝臟組織,行HE染色發(fā)現(xiàn)高脂+AAV-shCTL組小鼠肝臟組織內(nèi)內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪變性,尤其是匯管區(qū)域有炎癥細(xì)胞浸潤伴有部分點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死;在高脂+AAV-shHSPA1A/B組的小鼠肝臟組織內(nèi)脂肪變性程度有所減輕,炎癥細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞壞死程度也有所減輕。與此同時(shí)油紅O染色發(fā)現(xiàn):高脂+AAV-shCTL組小鼠肝臟組織內(nèi)內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴彌散分布于整個(gè)肝臟,脂滴形狀較大,數(shù)量多滿視野;在高脂+AAV-shHSPA1A/B組的小鼠肝臟組織內(nèi)脂滴數(shù)量有所減少,脂滴形狀有所減小,以匯管區(qū)減少較為明顯,說明肝臟組織脂肪變性程度有所減輕。而各組小鼠體重在病毒注射前后變化不明顯。結(jié)論:HSP70促進(jìn)脂質(zhì)合成增加進(jìn)而促進(jìn)NAFLD的發(fā)病過程,敲低HSP70使NAFLD的脂肪變性程度減輕。說明HSP70在NAFLD發(fā)病的過程中發(fā)揮重要作用。三、探討HSP70-FTO軸在NAFLD中的作用及機(jī)制研究目的:探討HSP70-FTO軸在NAFLD中的作用及機(jī)制研究方法:通過Western blot,共聚焦及等方法觀察HSP70對(duì)FTO的調(diào)控和共定位關(guān)系以及通過GST-pull down的方法進(jìn)一步驗(yàn)證HSP70和FTO之間的關(guān)系。通過慢病毒轉(zhuǎn)染Lenti-FTO及Lenti-Vector過表達(dá)FTO,以及通過慢病毒轉(zhuǎn)染si-FTO及si-Vector敲低FTO分別采用油紅O染色判斷細(xì)胞內(nèi)脂滴,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清內(nèi)甘油三酯(TG)及膽固醇(TC)水平,qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪合成相關(guān)酶FAS、SCD、ACC、的mRNA水平;再給予PA刺激24 h,觀察其對(duì)脂質(zhì)合成的影響。結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):在小鼠肝臟中過表達(dá)HSP70促進(jìn)FTO表達(dá)水平增高。體外實(shí)驗(yàn):我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HSP70促進(jìn)FTO表達(dá)水平增高,在PA干預(yù)24 h后蛋白水平增加。敲低HSP70能夠降低FTO表達(dá)水平,在PA干預(yù)24 h后蛋白水平較干預(yù)前增加。共聚焦結(jié)果分析表明,HSP70和FTO分布在正常情況下分布在細(xì)胞胞漿,在0.5 mM PA作用24h后HSP70和FTO蛋白富集在細(xì)胞核中,表明這兩種蛋白的活化。當(dāng)HSP70被敲低后,FTO在細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)給定0.5mM的PA刺激后,FTO富集在細(xì)胞質(zhì)膜和核膜,除了核。同樣在FTO敲低后,HSP70停留在細(xì)胞胞漿,但在0.5mM的PA刺激下,HSP70在細(xì)胞核中增多。綜上,這些結(jié)果表明,HSP70促進(jìn)FTO核轉(zhuǎn)移。GST-pull down顯示:GST-FTO,His-HSP70蛋白純化后,GST-pull down,GST-FTO結(jié)合HSP70,而GST蛋白不能結(jié)合HSP70,以上說明HSP70可以直接結(jié)合FTO。而且過表達(dá)FTO細(xì)胞內(nèi)脂滴與對(duì)照組相比輕微增多,在過表達(dá)FTO的基礎(chǔ)上再用0.5mM的棕櫚酸干預(yù)24h細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多。過表達(dá)FTO細(xì)胞上清內(nèi)TC、TG含量增多與對(duì)照組相比,在過表達(dá)FTO的基礎(chǔ)上再用0.5mM的棕櫚酸干預(yù)24h細(xì)胞上清內(nèi)TC、TG含量明顯增多。過表達(dá)FTO細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)酶FAS,SCD及ACC mRNA表達(dá)水平增高與對(duì)照組相比,在過表達(dá)FTO的基礎(chǔ)上再用0.5mM的棕櫚酸干預(yù)24h后,其水平增加不明顯。與此相反的是敲低FTO能減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成。結(jié)論:HSP70能上調(diào)NAFLD中FTO的表達(dá)。HSP70能直接結(jié)合FTO并且HSP70在高脂的作用下促進(jìn)FTO核內(nèi)轉(zhuǎn)移。表明HSP70通過調(diào)控FTO參與NAFLD的發(fā)病過程。HSP70-FTO軸與NAFLD的發(fā)病過程密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R575
【圖文】：

三者與 HSP70 之間相關(guān)性分別是 BMI (r = 0.18r = 0.1498, P =0.0062），血清 ALT（r = 0.1357, P =0.0131）。因LD 具有密切關(guān)系。表 1. 臨床研究對(duì)象的臨床和生化特征acteristics Control group NAFLD group Pber of subjects 167 167years) 57.63±0.6968 58.16±0.12 0，n(%) 86(167) 79(167)kg/m2） 23.53±0.19 27.03±0.31 <mmHg) 128.6±1.34 136.6±1.3 <mmHg) 74.04±0.77 80.40±0.77 <umol/l） 312.2±6.58 353.4±6.95 <mmol/l） 4.95±0.06 5.05±0.08 0mmol/l） 1.66±0.11 2.46±0.16 <（mmol/l） 1.51±0.03 1.27±0.02 <mmol/l） 2.68±0.05 2.83±0.06 0U/L） 20.05±0.8 32.12±1.58 <

上海交通大學(xué) 2015 級(jí)博士學(xué)位論文Figure 1-1.The association of serum HSP70 levels with human NAFLD. Serum HSP70 levels wereassayed by ELISA in normal individuals (n=167) and NAFLD individuals (n=167). **P < 0.01，vs.Control.3.2. NAFLD 小鼠肝臟組織內(nèi) HSP70 的表達(dá)3.2.1. 小鼠肝臟 HE 染色結(jié)果小鼠肝臟組織 HE 染色結(jié)果顯示, 正常飲食組的肝小葉紋理結(jié)構(gòu)清楚，無脂肪變性。高脂飲食組小鼠肝臟小葉內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性，大量氣球樣變性的空泡，特別是匯管區(qū)域有炎癥細(xì)胞浸潤以及部分點(diǎn)狀壞死的肝細(xì)胞（如圖 1-2）

24圖 1-3 HSP70 在 NAFLD 小鼠肝臟中表達(dá)上調(diào)。HSP70 在正常組與高脂組中的表達(dá)（A,免疫染色×200，×400）,Western blot 檢測(cè)組織內(nèi) HSP70、GAPDH 的蛋白水平（B）。（C）對(duì)條度值進(jìn)行定量。與對(duì)照組相比，* P<0.05Figure 1-3 The expression of HSP70 was up-regulated in the liver of NAFLD mice. Expression of HSP70 in ngroup and high fat group (A, immunohistochemical staining x 200, x 400),Western blot was used to test HSP70 pexpression(Figure 1-6B). HSP70 protein (Figure 1-6C) expression levels were evaluated by Western-blot and normto GAPDH levels. * P<0.05 compared with the control group.3.3. HSP70 在 PA 誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞脂肪變性中表達(dá)上調(diào)為了進(jìn)一步在體外探討 HSP70 在脂肪變性模型中的作用，我們利用 0.5mM PA HepG2 細(xì)胞 24 h 誘導(dǎo)脂肪變性模型，實(shí)時(shí)定量 PCR 測(cè)定 HSPA1AmRNA（A）, Weblot 檢測(cè)組織內(nèi) HSP70、GAPDH 的蛋白水平，我們發(fā)現(xiàn) HSP70 在 HepG2 細(xì)胞脂

【相似文獻(xiàn)】

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1 張潔蕾;HSP70-FTO軸在非酒精性脂肪性肝病中的作用及機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2767994