【摘要】：背景 HuD蛋白為ELAV家族的重要成員,特異性分布于神經(jīng)組織中。它通過結(jié)合神經(jīng)元內(nèi)特異表達(dá)的mRNA3'UTR ARE元件,穩(wěn)定mRNA并提高其翻譯效率,對神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化中有重要作用。現(xiàn)已證實(shí),HuD的低表達(dá)與視神經(jīng)發(fā)育障礙、先天性巨結(jié)腸等疾病相關(guān),其多克隆抗體anti-Hu抗體在副腫瘤綜合征、假性腸梗阻等多種疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演一定角色。表達(dá)并純化HuD蛋白,對研究其生物功能以及了解anti-Hu抗體在疾病中的作用有重要意義。 目的 構(gòu)建攜帶GST標(biāo)簽的小鼠HuD蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒,通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá),并進(jìn)行純化、鑒定。 方法 從小鼠腦組織中提取總mRNA,使用分子克隆技術(shù)RT-PCR特異擴(kuò)增HuD基因cDNA,并在5’、3’端添加酶切位點(diǎn),通過對RCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pGEX-6P-1雙酶切后連接,構(gòu)建GST-HuD融合蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1-HuD質(zhì)粒,并利用E.coli BL-21(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)小鼠HuD蛋白全長,親和層析純化后PreScissionTM蛋白酶切除GST標(biāo)簽,通過免疫印跡技術(shù)進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 獲得了純化的小鼠GST-HuD融合蛋白及小鼠HuD蛋白,經(jīng)鑒定其抗原表位具有生物免疫活性。 結(jié)論 通過分子克隆技術(shù)重建pGEX-6P-1-HuD質(zhì)粒,可表達(dá)小鼠GST-HuD融合蛋白,利用PreScissionTM蛋白酶酶切去除GST標(biāo)簽并進(jìn)行純化,所獲得小鼠HuD具備生物免疫活性,可用于anti-Hu抗體的制備及HuD蛋白生物功能的研究。 背景 Anti-Hu抗體是一種神經(jīng)元抗核抗體,又被稱為Ⅰ型神經(jīng)元抗核抗體,其存在于副腫瘤綜合征患者的血液及腦脊液中,與腸道動力異常有關(guān),被作為副腫瘤綜合征的血清標(biāo)記物,廣泛用于臨床診斷及預(yù)后評估。腸易激綜合征(IBS)是功能性腸病的一種主要類型,新近報道的一項(xiàng)研究表明,腸易激綜合征患者血清中抗腸神經(jīng)元抗體的陽性率高達(dá)79%,其中相當(dāng)一部分可能為anti-Hu抗體。進(jìn)一步明確Anti-Hu抗體與腸易激綜合征的關(guān)系對深入了解其在發(fā)病機(jī)制中的角色,探討其成為潛在的生物學(xué)標(biāo)記的價值具有重要意義。 目的 利用間接免疫熒光技術(shù)對IBS患者血清中抗腸神經(jīng)元抗體進(jìn)行檢測,應(yīng)用蛋白印跡以及酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對血清anti-Hu抗體進(jìn)行定性、定量檢測,并探討anti-Hu抗體與IBS發(fā)病的關(guān)系,及其在IBS診斷、治療及預(yù)后判斷方面的價值。 方法 收集并篩選IBS患者和健康對照血液標(biāo)本,以豚鼠腸黏膜下神經(jīng)叢鋪片為底物,通過間接免疫熒光技術(shù)檢測血清標(biāo)本中抗腸神經(jīng)元抗體陽性率。利用WesternBlot免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法定性、定量檢測血清anti-Hu抗體陽性率。應(yīng)用四格表法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析血清樣品anti-Hu抗體陽性率與IBS及其亞型IBS-C、IBS-D的關(guān)系。 結(jié)果 使用以豚鼠腸黏膜下神經(jīng)叢鋪片為底物的間接免疫熒光法檢測血清抗腸神經(jīng)元抗體,IBS組陽性率為51/81例,健康對照組為6/86例；通過免疫印跡法、ELISA法檢測血清anti-Hu抗體,IBS組陽性率為7/81例,健康對照組為0/86例。四格表統(tǒng)計(jì)分析,Anti-Hu抗體在IBS患者人群的陽性率(7/81例)顯著高于健康對照人群(0/90例(P=0.0164)。IBS-C型中陽性率(3/6例)顯著高于IBS-D型(4/75例)(P(雙)=0.0073,P(-)=0.0073,P(+)=0),但I(xiàn)BS-D與健康對照間無顯著差異(P=0.0967)。 結(jié)論 以豚鼠黏膜下神經(jīng)叢鋪片為底物的間接免疫熒光法顯示抗腸神經(jīng)元自身抗體在IBS的發(fā)病中存在一定聯(lián)系。Anti-Hu抗體作為常見的一種神經(jīng)元抗核抗體,可能是導(dǎo)致IBS原因之一。在IBS-C亞型中anti-Hu抗體的影響可能更為明顯。anti-Hu抗體是否可成為IBS的生物學(xué)標(biāo)記還需要進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 杜勇;施誠仁;潘駿;張文竹;;先天性巨結(jié)腸HuD蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J];臨床小兒外科雜志;2005年05期

本文編號：2767885