【摘要】：第一部分食管胃結(jié)合部平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定目的:探索最簡(jiǎn)單、有效的原代食管胃結(jié)合部平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法并鑒定平滑肌細(xì)胞特有表型。方法:選取2015年1月至2017年10月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院因中高位食管癌行食管大部切除術(shù)患者食管胃結(jié)合部平滑肌組織共24例,分別以酶消化法(enzymatic digestion with tissue blocks,ED)和組織塊法(explant culture with tissue blocks,EC-T)進(jìn)行平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)。ED組中,消化酶選擇膠原酶Ⅱ(collagenaseⅡ)和胰酶/EDTA消化液(Trypsin/EDTA),并以不同消化酶濃度結(jié)合不同消化溫度和消化時(shí)間探索最佳獲取原代細(xì)胞方法,記錄每200倍鏡視野可見(jiàn)貼壁細(xì)胞個(gè)數(shù)(Cells/200×)和原代細(xì)胞生長(zhǎng)至第一次傳代所需時(shí)間(first passage day,FPD);EC-T組中,對(duì)比傳統(tǒng)組織塊貼壁法(explant culture with tissue blocks,T)與胰酶消化輔助法(explant culture with trypsin digested-tissue,TD-T)和直接利用酶消化法中組織塊內(nèi)注射膠原酶Ⅱ提取細(xì)胞后的剩余組織塊(explant culture with enzyme injected-tissue,EI-T)三種方法,記錄初次見(jiàn)到細(xì)胞由組織塊爬出時(shí)間(visibility of cells migration,VCM)、FPD、初次分瓶時(shí)已爬出細(xì)胞的組織塊所占比例(Positive blocks(%)),選擇效率最高的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法;以CCK-8測(cè)定體外培養(yǎng)的細(xì)胞在平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基(smooth muscle cell medium,SMCM)和含10%新生牛血清的DMEM/F-12(10%-F12)培養(yǎng)基中的增殖的情況,并采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)、realtime RT-PCR、免疫熒光(immunofluore-scence,IF)、incellwestern方法檢測(cè)平滑肌組織和所獲得細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌22α(smooth muscle 22α,SM22α)、波形蛋白(vimentin)、肌間線(xiàn)蛋白(desmin)、分化抗原簇90(cluster of differentiation 90,CD90)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達(dá)情況,以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果:ED和EC-T兩種方法均可獲得原代細(xì)胞。ED組以Cells/200×比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.864),但以FPD進(jìn)行比較,可見(jiàn)以低濃度(0.5mg/ml)膠原酶Ⅱ注射入組織塊內(nèi)并低溫(4℃)、長(zhǎng)時(shí)間(14~24h)消化所得細(xì)胞的時(shí)間最短(中位時(shí)間8.00d,P0.05);EC-T組中,以EI-T法獲得的原代細(xì)胞在VCM(中位時(shí)間6.00d,P0.05)、FPD(中位時(shí)間15.50d,P0.05)、Positive blocks(%)(中位比例86.00%,P0.05)方面均優(yōu)于其他兩種方法;ED組和EC-T組總FDP比較顯示ED組明顯短于EC-T組(P=0.000)。所培養(yǎng)原代細(xì)胞以梭型和長(zhǎng)梭形為主,大小不均,可自行沿一定方向生長(zhǎng),表現(xiàn)為峰谷樣圖案;在SMCM中增殖良好,但在10%-F12中增殖效果不佳。這些細(xì)胞在SMCM中可傳代至第6~8代,但在10%-F12中僅可傳至第3~4代;細(xì)胞會(huì)隨著傳代次數(shù)增加體積逐漸增大并喪失梭形結(jié)構(gòu)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞同相應(yīng)平滑肌組織一樣,均可檢測(cè)到α-SMA、SM22α、Vimentin、Desmin、CD90和PCNA的mRNA和蛋白,但不同體外培養(yǎng)條件下其平滑肌標(biāo)志物表達(dá)水平不同,以10%-F12培養(yǎng)的細(xì)胞平滑肌標(biāo)志物表達(dá)水平均高于SMCM組。結(jié)論:以平滑肌標(biāo)志物鑒定ED法和EC-T法所獲得的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞,提取食管胃結(jié)合部平滑肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)是可行的;ED法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)周期短;以SMCM培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞可有效擴(kuò)大細(xì)胞種群,但以10%-F12培養(yǎng)的細(xì)胞具有更好的平滑肌細(xì)胞表型。第二部分乙酰膽堿對(duì)體外培養(yǎng)人食管胃結(jié)合部平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響目的:使用乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)對(duì)體外培養(yǎng)的人食管胃結(jié)合部(esophagogastric junction,EGJ)平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光變化的影響,明確各種平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光變化特點(diǎn),確定最佳體外人源性EGJ平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方式。方法:選取2016年11月至2017年10月因中高位食管癌行食管大部切除術(shù)患者共9例,以酶消化法和組織塊法獲取套索纖維、鉤狀纖維、食管環(huán)行肌、食管縱行肌、胃小彎側(cè)環(huán)行肌和胃大彎側(cè)環(huán)行肌6種人EGJ原代平滑肌細(xì)胞并分別以平滑肌培養(yǎng)基(smooth muscle cell medium,SMCM)和含10%新生牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基(10%-F12)進(jìn)行培養(yǎng)。以5μmol/L Fluo-3/am溶液負(fù)載體外培養(yǎng)的SMCM第3代和10%-F12第2代EGJ平滑肌細(xì)胞,在共聚焦顯微鏡下觀察10~-66 mM Ach對(duì)有鈣緩沖液和無(wú)鈣緩沖液中平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光的影響,記錄熒光活動(dòng)的起始值、峰值和結(jié)束值并記錄相應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)度,對(duì)比同種組織來(lái)源細(xì)胞鈣熒光在有鈣緩沖液和無(wú)鈣緩沖液以及鈣活動(dòng)前后的差異。結(jié)果:不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的EGJ平滑肌細(xì)胞存在不同的基礎(chǔ)鈣熒光。各組細(xì)胞加入Ach約2 s后即可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣熒光變化。食管縱行肌細(xì)胞、胃大彎側(cè)環(huán)形肌細(xì)胞和胃小彎側(cè)環(huán)形肌細(xì)胞鈣熒光活動(dòng)相對(duì)于套索纖維細(xì)胞、鉤狀纖維細(xì)胞和食管環(huán)行肌細(xì)胞溫和。在含鈣緩沖液中,各種細(xì)胞的基礎(chǔ)鈣熒光強(qiáng)于無(wú)鈣緩沖液,且鈣活動(dòng)總時(shí)間長(zhǎng),但熒光峰值不高。在無(wú)鈣緩沖液中,酶消化法獲得的細(xì)胞鈣熒光更多見(jiàn)典型的細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)鈣離子釋放,且仍可見(jiàn)較長(zhǎng)時(shí)間鈣活動(dòng)。鉤狀纖維、套鎖纖維、食管環(huán)行肌和胃小彎側(cè)環(huán)形肌以細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)鈣離子釋放為主要特點(diǎn),而食管縱行肌、胃大灣環(huán)形肌以細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流為主要特點(diǎn);以酶消化法獲取并以10%-F12培養(yǎng)的鉤狀纖維細(xì)胞、套索纖維細(xì)胞、食管環(huán)行肌細(xì)胞和食管縱行肌細(xì)胞在有鈣緩沖液和無(wú)鈣緩沖液中的鈣離子活動(dòng)峰值熒光差均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織塊法獲取的細(xì)胞中,僅胃大彎側(cè)環(huán)行肌和以10%-F12培養(yǎng)的套索纖維細(xì)胞峰值熒光差存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且各組細(xì)胞鈣活動(dòng)特點(diǎn)不如酶消化法組細(xì)胞典型。結(jié)論:在Ach誘發(fā)體外培養(yǎng)的EGJ平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光變化過(guò)程中,鉤狀纖維、套鎖纖維、食管環(huán)行肌、食管縱行肌、胃大彎側(cè)環(huán)形肌和胃小彎側(cè)環(huán)形肌均不單純依賴(lài)于某種鈣離子活動(dòng),而是將細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)鈣離子釋放與細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流相結(jié)合以有效維持較長(zhǎng)時(shí)間的鈣活動(dòng)。以酶消化法獲取細(xì)胞并以10%-F12進(jìn)行培養(yǎng)是最佳體外人EGJ平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方式。第三部分鈣離子相關(guān)蛋白及一氧化氮合酶在賁門(mén)失弛緩癥患者腹段食管環(huán)行肌中表達(dá)的初步研究目的:明確參與細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)變化的相關(guān)鈣離子蛋白和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)在賁門(mén)失弛緩癥(achalasia of the cardia,AC)患者腹段食管段環(huán)行肌的表達(dá)。方法:收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科AC患者共10例為實(shí)驗(yàn)組,選取因中高位食管癌行食管大部切除術(shù)患者共17例為對(duì)照組。手術(shù)中收集兩組賁門(mén)水平以上2~5cm以?xún)?nèi)腹段食管環(huán)行肌組織。以L(fǎng)-型鈣離子通道(L-type calcium channel,LTCC)、三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-triphosphate recptors,IP_3Rs)、雷諾定受體(ryanodine receptors,RyRs)三種大分子蛋白和NOS為研究對(duì)象,分別采用realtime RT-PCR和免疫組織化學(xué)(SP法)技術(shù)檢測(cè)LTCC、RyRs、IP_3Rs和NOS各亞型在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組表達(dá)的差異,同時(shí)以RT-PCR擴(kuò)增各cDNA并進(jìn)行堿基測(cè)序以明確判斷相應(yīng)mRNA是否表達(dá)。檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組各受體mRNA相對(duì)表達(dá)量與食管綜合松馳壓(integrated relaxation pressure,IRP)是否存在線(xiàn)性關(guān)系。結(jié)果:通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腹段食管環(huán)行肌(esophageal circular smooth muscle of control,EC)組織cDNA擴(kuò)增顯示,各蛋白亞型mRNA中i NOS、n NOS、Cav1.2、Cav1.3、RyR2、IP_3R1、IP_3R2和IP_3R3在兩組中均為陽(yáng)性表達(dá),但eNOS、Cav1.1、RyR1、RyR3不表達(dá);經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,iNOS、n NOS、Cav1.3、IP_3R1和IP_3R2的mRNA在AC表達(dá)均增高;iNOS和Cav1.3相對(duì)mRNA表達(dá)量與IRP之間存在正相關(guān)關(guān)系。通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè),在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平滑肌組織中n NOS、Cav1.2、Cav1.3、IP_3R1、IP_3R2、IP_3R3和RyR2 7種蛋白均表達(dá),其中n NOS局限分布于AC平滑肌組織中的神經(jīng)纖維并呈強(qiáng)陽(yáng)性染色,但平滑肌細(xì)胞質(zhì)染色較對(duì)照組明顯淺淡。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析僅IP_3R2在AC表達(dá)升高且與mRNA表達(dá)情況一致,兩組中其余蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:在賁門(mén)失弛緩癥患者腹段食管環(huán)行肌病理變化中,NOSs依然參與食管平滑肌病理狀態(tài)的調(diào)節(jié),但iNOS mRNA異常增高且n NOS在平滑肌細(xì)胞的表達(dá)明顯減少;鈣離子相關(guān)蛋白表達(dá)異常的肌源性因素也許在賁門(mén)失弛緩癥病理生理機(jī)制中扮演著重要角色。結(jié)論:1.以平滑肌標(biāo)志物鑒定酶消化法和組織塊法所獲得的食管胃結(jié)合部平滑肌組織來(lái)源的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞,提取食管胃結(jié)合部平滑肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)是可行的。在酶消化法中,以低濃度(0.5mg/ml)膠原酶Ⅱ注射于組織塊并在低溫(4℃)、長(zhǎng)時(shí)間(14~24h)條件下消化的方法獲取平滑肌細(xì)胞效率最佳且細(xì)胞培養(yǎng)周期短;以此殘余組織塊直接用于組織塊培養(yǎng)法,其獲取平滑肌細(xì)胞的效率最佳。體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞以合成型為主,形態(tài)學(xué)表現(xiàn)多為梭型和長(zhǎng)梭形;在不同培養(yǎng)條件下其平滑肌特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平不同;以專(zhuān)業(yè)培養(yǎng)基培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞可有效擴(kuò)大細(xì)胞種群,但以含10%新生牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞擁有更好的平滑肌細(xì)胞表型。2.在Ach誘發(fā)體外培養(yǎng)的食管胃結(jié)合部平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光變化過(guò)程中,體外培養(yǎng)的鉤狀纖維、套鎖纖維、食管環(huán)行肌和胃小彎側(cè)環(huán)形肌細(xì)胞以細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)鈣離子釋放為主要特點(diǎn);食管縱行肌、胃大彎側(cè)環(huán)形肌細(xì)胞以細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流為主要特點(diǎn)。但以上細(xì)胞均不單純依賴(lài)于某種鈣離子活動(dòng),而是將細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)鈣離子釋放與細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流相結(jié)合以有效維持較長(zhǎng)時(shí)間的鈣活動(dòng),尤以酶消化法獲取并以含10%新生牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞在乙酰膽堿介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化中表現(xiàn)最佳,可作為最佳人EGJ平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方式。3.在賁門(mén)失弛緩癥患者腹段食管環(huán)行肌病理變化中,一氧化氮合酶依然參與食管平滑肌病理狀態(tài)的調(diào)節(jié),但誘生型一氧化氮合酶mRNA異常增高且神經(jīng)元型一氧化氮合酶在平滑肌細(xì)胞的表達(dá)明顯減少。鈣離子相關(guān)蛋白表達(dá)異常的肌源性因素也許在賁門(mén)失弛緩癥病理生理機(jī)制中扮演著重要角色,其與一氧化氮合酶的相應(yīng)變化在賁門(mén)失弛緩癥病理生理過(guò)程中的作用應(yīng)受到關(guān)注。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R571
【圖文】：

圖 1 食管胃結(jié)合部（黏膜側(cè)）Fig. 1 Mucosa side of esophagogastric junction圖 2 酶消化法獲得的食管胃結(jié)合部原代細(xì)胞

酶消化法獲得的食管胃結(jié)合部原代細(xì)胞Fig.2Primarycellsofesophagogastricjunction(EGJ)obtainedby

圖 3 不同酶消化法獲得原代細(xì)胞的比較Fig. 3 Comparison of different ED methods to obtain primary cellsThere was no statistical difference in Cells/200× (P=0.864), but it wasstatistical different to compare 0.5-EI-4 with 0.5-C-4 (P=0.006) and 0.25-T-37(P=0.004) in the first passage day (FPD) respectively. (*P＜0.05)圖 4 未經(jīng)酶消化輔助（T 組）組織塊中細(xì)胞生長(zhǎng)示圖（×100，以 EC 為例）Fig. 4 Primary esophageal circular muscle (EC) cells obtained by traditional

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10 宋健 雷根平 陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 沈舒文名醫(yī)工作室;治賁門(mén)失弛緩癥 潤(rùn)降胃氣開(kāi)痰結(jié)[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2015年

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1 高楊;人食管胃結(jié)合部平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及賁門(mén)失弛緩癥患者腹段食管環(huán)行肌舒縮信號(hào)分子表達(dá)的初步研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

2 劉慶森;內(nèi)鏡下注射A型肉毒毒素治療賁門(mén)失弛緩癥的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2004年

3 徐恩斌;乙酰膽堿酯酶基因治療賁門(mén)失弛緩癥的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 寧守斌;內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因轉(zhuǎn)移治療實(shí)驗(yàn)性賁門(mén)失弛緩癥[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

5 崔釗;超聲內(nèi)鏡及定時(shí)吞鋇檢查在賁門(mén)失弛緩癥診療中的應(yīng)用價(jià)值[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

6 史永軍;內(nèi)鏡下經(jīng)隧道治療食管相關(guān)性疾病的臨床研究[D];山東大學(xué);2014年

7 湯小偉;粘膜下隧道內(nèi)鏡技術(shù)用于治療賁門(mén)失遲緩癥與上消化道粘膜下腫瘤的系列臨床研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王娟;環(huán)形肌切開(kāi)和全層肌切開(kāi)治療賁門(mén)失弛緩癥長(zhǎng)期隨訪(fǎng)研究[D];鄭州大學(xué);2018年

2 趙冬瑤;高分辨率食管測(cè)壓在賁門(mén)失弛緩癥經(jīng)口內(nèi)鏡肌切開(kāi)術(shù)效果評(píng)價(jià)中的價(jià)值[D];鄭州大學(xué);2018年

3 曾建梅;血清IL-4、IL-13與賁門(mén)失弛緩癥的相關(guān)性研究及POEM治療賁門(mén)失弛緩癥的中期療效分析[D];西南醫(yī)科大學(xué);2018年

4 竇麗紅;POEM治療賁門(mén)失弛緩癥44例療效分析[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2018年

5 牟丹;經(jīng)口內(nèi)鏡下肌切開(kāi)術(shù)治療賁門(mén)失弛緩癥的長(zhǎng)期有效性及安全性的單中心回顧性分析[D];山東大學(xué);2017年

6 王亞;POEM治療賁門(mén)失弛緩癥中氣體相關(guān)并發(fā)癥的治療及預(yù)防[D];浙江大學(xué);2017年

7 寧華漢;POEM手術(shù)對(duì)不同壓力分型AC患者治療效果的分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2017年

8 陳津津;經(jīng)口內(nèi)鏡下肌切開(kāi)術(shù)治療賁門(mén)失弛緩癥中長(zhǎng)期療效的meta分析和系統(tǒng)評(píng)價(jià)[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2017年

9 李婉君;賁門(mén)失弛緩癥臨床分析[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2016年

10 向正國(guó);一氧化氮在犬賁門(mén)失弛緩癥模型食管下括約肌中的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2000年

本文編號(hào)：2765377