【摘要】：研究背景：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪蓄積為病理特征,但無過量飲酒史且排除其他肝病的臨床綜合征,疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝纖維化、脂肪性肝硬化等類型。該病平均累及世界總?cè)丝诘?5%-30%,在肥胖人群中的發(fā)病率更高,明顯超過乙型肝炎、丙型肝炎及酒精性肝病的發(fā)病率,成為最常見的慢性肝病。近年來,隨著人民生活水平的提高和生活方式的改變,我國的患病率呈逐年上升趨勢。然而,NAFLD的具體病理機(jī)制尚不明確。 既往的研究表明,NAFLD的發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗(IR)有關(guān),而近年來研究表明微囊蛋白-1(caveolin-1,cavl)和胰島素抵抗有關(guān),提示cavl可能在代謝性疾病中發(fā)揮作用。 有研究表明,caV1過表達(dá)后能顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取氧化性低密度脂蛋白而cavl低表達(dá)后能抑制HepG2細(xì)胞吸收長鏈3H油酸,提示cavl介導(dǎo)脂質(zhì)吸收的作用可能促進(jìn)NAFLD的形成。然而,cavl是否參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程尚不明確。本文采用高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)建立C57BL/6小鼠NAFLD模型,通過qPCR、 Western blot、免疫組化檢查等方法檢測cavl在NAFLD小鼠肝臟中的mRNA、蛋白水平以及分布的變化,探討cavl在NAFLD發(fā)病中的作用。 目的本研究旨在通過觀察患NAFLD的C57BL/6小鼠肝組織中cavl基因、蛋白與分布的變化,進(jìn)而探討其在脂肪肝病理生理機(jī)制中的作用。 方法 1給予C57BL/6小鼠14周的高脂高膽固醇飼料,即標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上添加15%的豬油和1.25%的膽固醇,建立NAFLD動物模型(實驗組),而僅用標(biāo)準(zhǔn)飼料(脂肪4%,膽固醇0.02%)喂養(yǎng)的小鼠為對照組。NAFLD模型建立后行動物解剖,取血和肝組織以備檢測。 2小鼠取血后,分離血清,檢測兩組小鼠血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇的濃度(LDL-C). 3從小鼠肝臟組織中提取RNA,然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,根據(jù)合成的cavl引物進(jìn)行實時熒光定量PCR(SYBR法),對cavl的mRNA在兩組小鼠中的變化進(jìn)行相對定量分析。 4從小鼠肝臟組織中提取總蛋白,行Western Blot,觀察實驗組和對照組小鼠肝臟中cavl在蛋白水平的變化,進(jìn)一步證實其變化是否與mRNA水平變化相對應(yīng)。 5將小鼠肝臟組織用福爾馬林固定,先做病理切片初步觀察肝臟組織在對照組和實驗組的變化；并將實驗組小鼠進(jìn)行脂變分度。 6將固定好的小鼠肝臟組織水化后進(jìn)行免疫組化,進(jìn)一步確定cavl在兩組小鼠肝臟組織中的分布特點及其分布的變化。 結(jié)果 1給予實驗組小鼠14周的高脂高膽固醇飼料后,所有小鼠均患NAFLD. 2實驗組小鼠血清總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇比對照組升高(TC:3.771±0.804mmol/L vs.1.940±0.300mmol/L, P0.01; HDL-C:2.224±0.428vs.1.120±0.066, P0.01; LDL-C:1.241±0.663vs.0.510±0.191, P0.01),而甘油三酯無統(tǒng)計學(xué)差異(0.719±0.383vs.0.710±0.487, P0.05). 3實驗組小鼠肝組織cavl基因表達(dá)比對照組明顯升高(1.536±0.226vs.0.980±0.272,P0.05)。 4Western Blot結(jié)果證實實驗組小鼠肝組織cav1蛋白比對照組明顯升高(0.643±0.240vs.0.100±0.130,P0.01),與其基因變化一致。 5實驗組肝臟組織的病理結(jié)果顯示脂肪肝存在,且5只小鼠為可疑非酒精性脂肪性肝炎(NASH),7只小鼠為非酒精性單純性脂肪肝(NAFL). 6免疫組化結(jié)果顯示cavl在實驗組小鼠肝臟中的分布增加(0.251±0.0380vs.0.137±0.0003,P0.05),主要位于肝細(xì)胞膜、脂滴膜及胞漿中,比對照組中cavl在肝竇狀區(qū)分布明顯增加；cavl在肝組織中的表達(dá)增加隨著脂肪肝嚴(yán)重程度的加劇而更加明顯。 結(jié)論本實驗利用高脂高膽固醇飲食成功建立NAFLD小鼠模型,實驗組小鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C顯著升高,肝組織cavl的基因及蛋白表達(dá)量顯著增加,肝組織cavl分布增加,主要分布在肝細(xì)胞膜、脂滴膜及胞漿中,且cavl的表達(dá)強(qiáng)度與脂肪肝的程度有關(guān),這些結(jié)果提示cavl在高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NAFLD中發(fā)揮一定的作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.5

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