【摘要】： 目的：研究結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1 (Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)表達(dá)質(zhì)粒重組體分別轉(zhuǎn)染及共轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell T6,HSC-T6)后CTGF、TIMP-1、procol-α1 mRNA基因表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)分泌的影響,來探索肝纖維化的發(fā)生機制。方法：將已篩選并成功構(gòu)建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干擾靶位的shRNA表達(dá)質(zhì)粒重組體,以轉(zhuǎn)染試劑Lipfectamine 2000分別及共轉(zhuǎn)染經(jīng)TGF-β1刺激活化的大鼠HSC-T6,另設(shè)空質(zhì)粒組、只加轉(zhuǎn)染試劑組及空白對照組,每組6復(fù)孔,流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率；36h后抽提RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA通過熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中CTGF/TIMP-1、procol-α1 mRNA的表達(dá)；放射免疫法(Radioimmunoassay, RIA)分析細(xì)胞上清液中Ⅲ型前膠原(Procollagentype-Ⅲ,PCⅢ)、透明質(zhì)酸(Hexadecenoic acid, HA)和層粘連蛋白(laminin, LN)的含量。結(jié)果：與空白對照組相比,空質(zhì)粒對照組、只加轉(zhuǎn)染試劑組對基因表達(dá)及ECM的分泌均無影響,而CTGFshRNA和TIMP-1 shRNA能明顯抑制CTGF、TIMP-1、procol-α1 mRNA的表達(dá),降低上清液中PCⅢ、HA和LN的含量,雙重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HSC-T6后其對procol-α1 mRNA和ECM的抑制程度優(yōu)于單重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(P0.01或P0.05)。結(jié)論：1.CTGFshRNA、TIMP-1shRNA可明顯抑制HSC的CTGF、TIMP-1、procol-α1基因表達(dá)及ECM的分泌,且聯(lián)合干擾較單獨干擾效果更強。2.多基因共轉(zhuǎn)染作為抗纖維化基因治療的方法,其治療效果可能會優(yōu)于單基因轉(zhuǎn)染。
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.2
【圖文】：

1細(xì)胞形態(tài)變化及轉(zhuǎn)染效率在普通倒置顯微鏡下見A組細(xì)胞輪廓清晰、平滑、細(xì)胞透亮、生長狀態(tài)好(圖1)。而轉(zhuǎn)染組(B、C、D、E和F組)細(xì)胞生長狀態(tài)差，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、形態(tài)變圓、與鄰近細(xì)胞分離、細(xì)胞漂浮增多等改變(圖2);熒光顯微鏡下觀察:A、B組細(xì)胞無熒光顯示，C、D、E、F組均有熒光顯示;流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)A、B組細(xì)胞中均無熒光蛋白的表達(dá)，C、D、E、F組中可測到熒光蛋白的表達(dá)(圖3，圖4)，36h質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率見表2，C、D、E、F組組間差異無顯著性(尸>0.05)，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率基本相同，排除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的不同而對實驗結(jié)果的影響。表5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(%)幾 ble5Floweytometryeelltransfectioneffieieney(%)C組D

在普通倒置顯微鏡下見A組細(xì)胞輪廓清晰、平滑、細(xì)胞透亮、生長狀態(tài)好(圖1)。而轉(zhuǎn)染組(B、C、D、E和F組)細(xì)胞生長狀態(tài)差，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、形態(tài)變圓、與鄰近細(xì)胞分離、細(xì)胞漂浮增多等改變(圖2);熒光顯微鏡下觀察:A、B組細(xì)胞無熒光顯示，C、D、E、F組均有熒光顯示;流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)A、B組細(xì)胞中均無熒光蛋白的表達(dá)，C、D、E、F組中可測到熒光蛋白的表達(dá)(圖3，圖4)，36h質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率見表2，C、D、E、F組組間差異無顯著性(尸>0.05)，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率基本相同，排除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的不同而對實驗結(jié)果的影響。表5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(%)幾 ble5Floweytometryeelltransfectioneffieieney(%)C組D組E組F組HSC一 T625.9士 1.622.5士 1.821.8士 1.222.3士1.2注:C、D、E、F組間比較(P>0.05)圖1正常細(xì)胞在光鏡下形態(tài)xloo Figlnormaleellslight

微鏡下觀察:A、B組細(xì)胞無熒光顯示，C、D、E、F組均有熒光顯示;流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)A、B組細(xì)胞中均無熒光蛋白的表達(dá)，C、D、E、F組中可測到熒光蛋白的表達(dá)(圖3，圖4)，36h質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率見表2，C、D、E、F組組間差異無顯著性(尸>0.05)，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率基本相同，排除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的不同而對實驗結(jié)果的影響。表5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(%)幾 ble5Floweytometryeelltransfectioneffieieney(%)C組D組E組F組HSC一 T625.9士 1.622.5士 1.821.8士 1.222.3士1.2注:C、D、E、F組間比較(P>0.05)圖1正常細(xì)胞在光鏡下形態(tài)xloo Figlnormaleellslight mieroseopeX100圖2轉(zhuǎn)染36h后細(xì)胞在光鏡下形態(tài)xloo FigZtransfeetionfor36hlight microscopeX100

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本文編號：2764256