發(fā)布時間：2020-07-20 08:08

【摘要】：肝纖維化(liver fibrosis)是由于病毒、代謝、遺傳和膽汁淤積等多種原因導致以細胞外基質(extracellular matrix, ECM)過度沉積為特征的慢性肝損傷。肝纖維化最終導致肝硬化,部分進展為肝癌,因此肝纖維化是一個世界性的公共健康問題。肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是產生ECM的主要細胞來源,是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。 肝星狀細胞是肝臟的非實質細胞,主要以儲存維生素A的靜止形式存于正常肝臟中。然而,大量體內外研究發(fā)現(xiàn)多種致病因素作用致肝損傷,HSC失去維生素A變?yōu)楸磉_α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的活化的HSC,并不斷增殖,分泌豐富的I型膠原而促進肝纖維化的發(fā)展。多種細胞因子可以導致HSC增殖和膠原合成,如:血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和轉化生長因子-β1 (transforming growth factor beta 1, TGF-β1)。因此,探討HSC活化增殖的的機制,可能為肝纖維化治療提供新的思路。 肝素結合性表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, HB-EGF)是表皮生長因子受體家族的配體之一,可以結合并激活表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR/ErbB1)和ErbB4受體,進而激活絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號轉導通路。最近的研究表明,HB-EGF能夠刺激多種細胞增殖。CRM197是一種無毒性的白喉毒素突變體,是HB-EGF的特異性抑制劑,通過結合可溶性的HB-EGF阻斷它與ErbB受體的結合和下游的信號反應。 細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated kinase, ERK)是MAPK家族成員之一,PDGF和EGF等多種細胞因子通過各自受體激活Ras/Raf/ ERK信號轉導通路,傳導細胞增殖信號。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt信號通路可被多種生長因子和促有絲分裂原活化,對調控細胞周期、促進細胞分化和細胞生長起重要作用。Ras/Raf/ERK和PI3K/Akt信號通路在HSC的增殖、凋亡和膠原合成中發(fā)揮至關重要的作用。 本課題旨在研究HB-EGF對兩種HSC細胞株(人HSC細胞株LX2和大鼠HSC細胞株T6)和原代HSC增殖和凋亡的影響及可能的分子機制。實驗由以下三部分組成: 第一部分:HB-EGF在原代大鼠HSC中的表達 目的:研究HB-EGF在HSC活化過程中的作用。 方法:采用鏈酶、IV型膠原酶原位灌注肝組織和Nycodenz梯度離心技術分離大鼠原代HSC,采用熒光顯微鏡和α-SMA做免疫細胞化學染色的方法鑒定原代HSC。用免疫細胞化學和Western blot檢測靜止和激活的原代HSC中HB-EGF、phospho-EGFR、EGFR和ErbB4的表達;Western Blot檢測CRM197干預靜止狀態(tài)的HSC后phospho-EGFR、EGFR和ErbB4的表達。 結果:①HSC的細胞的得率為1.5～2.0×107/只,細胞存活率和純度均大于90%。剛分離的HSC呈圓形,胞漿內含有豐富的脂滴,在波長328 nm的熒光顯微鏡下觀察,能激發(fā)出熒光。HSC培養(yǎng)10天,靜止的細胞變?yōu)榛罨癄顟B(tài),富含維生素A的脂滴消失,變?yōu)樗笮位蛐切�。②大鼠原代HSC性質鑒定。未激活的HSC內不表達α-SMA;細胞培養(yǎng)14天后,全部激活的HSC胞漿內呈現(xiàn)α-SMA表達。③HB-EGF及ErbB受體在原代大鼠HSC激活后表達明顯增加。剛分離的大鼠原代HSC內幾乎不表達HB-EGF及其受體;而激活后的HSC內HB-EGF和ErbB受體表達明顯增加�？偟腅GFR在原代HSC激活前后表達水平無明顯差異。④CRM197對靜止的大鼠HSC無明顯作用。CRM197 (20μg/ml)干預剛分離的大鼠原代HSC,EGFR的磷酸化和ErbB4水平與對照組相比無明顯差異。 結論:靜止狀態(tài)的原代大鼠HSC內幾乎沒有HB-EGF的表達,而HSC激活后HB-EGF表達明顯增加,HB-EGF在原代HSC激活前后的改變可能預示著肝纖維化與HB-EGF這種細胞因子及其由它激活的下游信號通路密切相關。 第二部分:HB-EGF促進HSC增殖、抑制凋亡 目的:探討HB-EGF和CRM197在HSC增殖和凋亡中的作用。 方法:HB-EGF不同濃度(10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)和時間點(12 h, 24 h, 48 h)干預活化的人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代大鼠HSC,四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法檢測細胞增殖變化、溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU)標記的摻入法測定細胞DNA合成。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD98059和25μmol/L LY294002同時干預經HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代大鼠HSC,MTT檢測細胞增殖變化、BrdU摻入檢測HSC DNA合成。CRM197預處理細胞24小時后更換培養(yǎng)基,給予HB-EGF 40 ng/ml干預LX2和T6和原代大鼠肝星狀細胞24 h,透射電鏡觀察細胞形態(tài)學改變。末段脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標記(terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL)檢測HSC凋亡。CRM197預處理細胞24小時后,給予HB-EGF (10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)干預HSC-T6和LX2細胞株12 h,24 h和48 h。膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(Propidium iodide, PI)聯(lián)合標記流式細胞術檢測HSC凋亡率和Caspase-3活性。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD9805925和25μmol/L LY294002同時干預經HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代大鼠HSC,流式細胞術檢測細胞凋亡率。 結果:①HB-EGF能刺激人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代HSC增殖。MTT檢測顯示不論CRM197抑制與否,HB-EGF均呈濃度和時間依賴性的刺激以上三種細胞增殖,其中HB-EGF高劑量組(40 ng/ml)干預24 h,使LX2、T6和原代HSC細胞增殖分別較對照組的100%增加至137.11±8.44% (P0.05)、138.74±6.21% (P0.05)和129.92±4.68% (P0.05);CRM197能抑制HB-EGF刺激后引起的HSCs增殖。②PDGF (20 ng/ml)刺激三種HSC增殖與HB-EGF (40 ng/ml)刺激增殖的作用相比無明顯差異;CRM197發(fā)揮了與EGFR受體阻斷劑類似的抑制作用。AG1478顯著抑制了HB-EGF刺激的HSC增殖,與CRM197的抑制作用相比無明顯差異;PD98059和LY294002均分別顯著抑制了HB-EGF刺激后HSCs的增殖,與CRM197的抑制作用相比顯著增加。③HB-EGF呈濃度和時間依賴性地刺激HSC DNA合成。BrdU-DNA摻入法測定結果顯示HB-EGF高劑量組(40 ng/ml)干預24 h,使LX2、T6和原代HSC細胞DNA合成分別較對照組的100%增加至160.77±13.62% (P0.05)、154.33±5.55% (P0.05)和130.92±1.74% (P0.05);CRM197能夠明顯抑制HB-EGF刺激后引起的HSC DNA合成。④CRM197抑制人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代HSC DNA合成,較HB-EGF刺激組相比明顯降低(68.87±5.57% vs 160.90±13.57%, P0.05; 74.67±4.43% vs 154.33±5.55%, P0.05; 76.30±6.85% vs 130.92±1.74%, P0.05);AG1478、PD98059和LY294002均分別顯著抑制了HB-EGF刺激后HSC的DNA合成。⑤透射電鏡下觀察HSC形態(tài)變化。濃度為20μg/ml的CRM197干預HSC 24 h后,細胞呈現(xiàn)凋亡特征:細胞體積變小,染色質凝集,新月體形成,核膜皺褶,粗面內質網擴張。⑥與對照組相比,20μg/ml CRM197分別提高LX2、T6和原代HSC細胞TUNEL染色陽性細胞率8.87倍(P0.05), 7.54倍(P0.05)和6.54倍(P0.05)。⑦HB-EGF抑制Caspase-3活性;20μg/ml CRM197分別將LX2、T6和原代HSC細胞Caspase-3的活性提高了1.56倍(P0.05), 1.65倍(P0.05)和1.70倍(P0.05)。 結論:HB-EGF能夠刺激HSC增殖和DNA合成;CRM197能夠誘導HSC凋亡,這種作用可能與Caspase-3的活性相關。 第三部分:HB-EGF對肝星狀細胞增殖與凋亡影響的信號轉導機制 目的:探討HB-EGF對HSC細胞內ErbB受體以及下游的ERK和Akt信號轉導通路的調節(jié)作用。 方法:HB-EGF或CRM197干預HSC 24 h后,免疫細胞化學和Western blot檢測EGFR、ErbB4和p-EGFR的蛋白表達變化。經或不經CRM197 (20μg/ml)干預HSC 24 h后,以不同濃度的HB-EGF (10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)刺激HSC-T6、LX2細胞株和原代大鼠HSC 24 h,Western blot檢測EGFR、ErbB4、ERK、Akt、p-EGFR、p-ERK和p-Akt的蛋白表達變化;RT-real time PCR測定EGFR和ErbB4 mRNA的表達。經或不經CRM197 (20μg/ml)干預HSC 24 h后,以HB-EGF (40 ng/ml)刺激HSC-T6、LX2細胞株和原代大鼠HSC 12 h,24 h和48 h,Western blot檢測EGFR、ErbB4、ERK、Akt、p-EGFR、p-ERK和p-Akt的蛋白表達變化;RT-real time PCR測定EGFR和ErbB4 mRNA的表達。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD98059和25μmol/L LY294002同時干預經HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代HSC,橫向比CRM197與三種抑制劑對以上信號分子的作用。 結果:①在HSC細胞核和細胞漿中均表達ErbB受體,HB-EGF能刺激HSC中p-EGFR和ErbB4表達增加;CRM197抑制p-EGFR和ErbB4的表達。②HB-EGF刺激HSC中ErbB4 mRNA水平表達增加;EGFR mRNA水平在原代HSC的各組間變化不明顯。③HB-EGF上調兩種HSC細胞株(LX2、T6)和原代HSC中ErbB受體和下游的ERK、Akt信號分子磷酸化水平,呈時間和劑量依賴性;CRM197抑制HB-EGF激活的LX2、T6和原代HSC內ErbB受體的表達,繼而抑制了ERK和Akt信號通路的磷酸化。④CRM197發(fā)揮了與EGFR受體相應阻斷劑類似的抑制作用。AG1478抑制了HB-EGF刺激后EGFR受體的磷酸化水平,繼而抑制了下游的ERK和Akt信號分子的磷酸化水平,而CRM197則同時抑制了EGFR受體的磷酸化和ErbB4受體。⑤CRM197發(fā)揮了與ERK和Akt信號通路相應阻斷劑類似的抑制作用。PD98059和LY294002均分別顯著抑制了HB-EGF刺激后HSC內ERK和Akt信號分子的磷酸化水平,而CRM197則同時抑制了HB-EGF刺激后這兩條信號通路的磷酸化,但是與PD98059和LY294002的抑制作用相比顯著降低。 結論:HB-EGF可能通過EGFR和ErbB4受體,激活ERK和Akt兩條細胞內信號轉導通路,實現(xiàn)促進HSC增殖、抑制HSC凋亡的作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：2763176