發(fā)布時(shí)間：2020-07-19 19:00

【摘要】：目的探討PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)與HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系,了解其作用的生物學(xué)基礎(chǔ)；探討胎盤(pán)細(xì)胞凋亡對(duì)胎盤(pán)通透性的影響,了解其與PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)及新生兒HBV感染的關(guān)系；探討PBMC作為HBV的載體,將孕婦體內(nèi)HBV轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒體內(nèi)導(dǎo)致HBV宮內(nèi)感染的作用機(jī)制。 方法1.人群研究 連續(xù)收集2005年1月至2009年2月間太原市區(qū)各省市級(jí)醫(yī)院篩檢,并在太原市傳染病院(太原市第三人民醫(yī)院)婦產(chǎn)科進(jìn)行產(chǎn)前檢查并分娩的HBsAg陽(yáng)性孕婦為研究隊(duì)列,從產(chǎn)前檢查追蹤觀察至分娩,排除孕期有其他感染性疾病或接受免疫治療的孕婦,共收集HBsAg陽(yáng)性孕婦及其新生兒共450對(duì)作為研究對(duì)象。收集孕婦孕期及產(chǎn)后新生兒的流行病學(xué)基線資料；采集孕婦分娩前肘靜脈血及其新生兒出生24小時(shí)內(nèi)注射乙肝疫苗和乙肝高效價(jià)免疫球蛋白(HBIG)前的股靜脈血；無(wú)菌條件下采集孕婦足月分娩時(shí)胎盤(pán)組織。進(jìn)行下述研究： (1)采用等位基因特異性PCR(As-PCR)法檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性孕婦及其新生兒PBMC中HUMGSTM1、ACE基因多態(tài)性,篩選母親為GSTM1基因表達(dá)型(GSTM1+)和/或?yàn)锳CE基因雜合子(ID型),且其新生兒為GSTM1基因缺失型(GSTM1-)和/或?yàn)锳CE基因純合子(純合插入Ⅱ型或純合缺失DD型)者作為信息病例對(duì)。將GSTM1和ACE基因作為母親的特異性等位基因,從信息病例對(duì)的新生兒外周血PBMC中檢測(cè)母親基因,判定是否發(fā)生PBMC母一胎轉(zhuǎn)運(yùn)。 (2)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)上述方法確定的信息病例對(duì)中孕婦及其新生兒外周血HBeAg、HBe-Ab、HBc-Ab及新生兒外周血HBsAg. (3)采用熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR)檢測(cè)信息病例對(duì)中母兒外周血血清、PBMC中HBV DNA含量及PBMC HBV cccDNA含量。 (4)采用FQ-PCR檢測(cè)新生兒PBMC中的母親信息,用△Ct值(Ct目的基因/Ctβ-globin)表示PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)量。 (5)采用免疫組織化學(xué)ABC法檢測(cè)胎盤(pán)組織HBsAg。 (6)采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的核苷酸(dUTP)缺口末端標(biāo)記法,原位末端標(biāo)記技術(shù)(Tune1法)檢測(cè)胎盤(pán)組織凋亡指數(shù)(AI),采用免疫組化SP法檢測(cè)胎盤(pán)組織Caspase3蛋白表達(dá),采用real-time RT-PCR檢測(cè)胎盤(pán)組織Caspase3mRNA表達(dá)。 (7)采用巢式病例對(duì)照研究分析母-胎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及新生兒PBMC HBV感染復(fù)制及宮內(nèi)感染的危險(xiǎn)因素研究。 (8)采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)PBMC涂片上HBsAg和GST,判斷感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)情況。 2.體外實(shí)驗(yàn) (1)采用100μlHBV DNA含量為5.0×106(copies/ml)的病人血清感染PBMC,用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同共培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)12h、24h、48h和72h細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。將共培養(yǎng)的細(xì)胞清洗4次,用熒光定量PCR法檢測(cè)PBMC和洗液中的HBV DNA的含量。 (2)在1μm孔徑Transwell小室共培養(yǎng)模型中,用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測(cè)Transwell小室上室感染HBV的PBMC與Bewo的融合現(xiàn)象。再用8μm孔徑Transwell小室共培養(yǎng)模型觀察PBMC的遷移,用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測(cè)下室中標(biāo)記有綠色熒光的PBMC。 (3)共培養(yǎng)時(shí)設(shè)立三個(gè)組：正常對(duì)照組(Bewo)、Bewo+HBV血清共培養(yǎng)組、Bewo+感染HBV的PBMC共培養(yǎng)組,在共培養(yǎng)0h、12h、24h、48h后分別收集各組Bewo細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測(cè)Bewo的凋亡情況。 (4)用FQ-PCR法檢測(cè)感染HBV的PBMC與Bewo共培養(yǎng)組不同時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24h、48h)的Bewo細(xì)胞caspases3mRNA的表達(dá)情況。 (5)用FQ-PCR法檢測(cè)感染HBV的PBMC與Bewo共培養(yǎng)組下室中的PBMC的HBVDNA和HBV cccDNA含量。 3.統(tǒng)計(jì)分析 資料核實(shí)后輸入數(shù)據(jù)庫(kù),采用SPSS16.0for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2-test,計(jì)算各指標(biāo)陽(yáng)性率、χ2值、OR值及其95%可信區(qū)間；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、方差分析及相關(guān)性分析。 結(jié)果1HBsAg陽(yáng)性孕婦PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)與孕婦HBV感染及新生兒HBV感染的關(guān)系 (1)對(duì)連續(xù)收集的450對(duì)HBsAg陽(yáng)性孕婦及其新生兒的PBMC采用等位基因特異性PCR檢測(cè)GSTM1、ACE基因多態(tài)性：檢出86對(duì)母親GSTM1基因型且其新生兒GSTM1基因型的信息病例對(duì),84對(duì)母親ID基因型且其新生兒II/DD基因型的信息病例對(duì),合計(jì)將GSTM1、ACE基因作為母親的特異性等位基因時(shí),共檢出155對(duì)信息病例對(duì)。 (2)孕婦HBsAg、HBeAg雙陽(yáng)性組△Ct值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globin Ct值)低于非雙陽(yáng)性組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.81,P=0.42)；孕婦大、小三陽(yáng)組△Ct值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globinCt值)均分別低于非大、小三陽(yáng)組(t=1.42,P=0.16；t=0.02,P=0.98),但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBsAg陽(yáng)性孕婦血清HBV DNA各組△Ct值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globinCt值)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.37,P0.05)。 (3) HBsAg陽(yáng)性孕婦PBMC HBV DNA陽(yáng)性組△Ct值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globin Ct值)低于陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.42,P=0.00)；HBsAg陽(yáng)性孕婦PBMC HBV cccDNA陽(yáng)性組△Ct值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globin Ct值)高于陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.13,P=0.04)。 (4)將新生兒血清HBsAg、HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒宮內(nèi)感染的指標(biāo),則宮內(nèi)感染組△Ct值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globin Ct值)高于非宮內(nèi)感染組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.34,P=0.73)。將新生兒血清HBsAg、HBV DNA及PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒宮內(nèi)感染的指標(biāo),則宮內(nèi)感染組ACt值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globin Ct值)低于非宮內(nèi)感染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t’=6.25,P=0.00)。 2.胎盤(pán)HBV感染與HBsAg陽(yáng)性孕婦母-胎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及新生兒HBV感染的關(guān)系 (1)胎盤(pán)HBV感染組△Ct值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globin Ct值)高于非感染組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.38,P=0.70)；胎盤(pán)各型細(xì)胞HBV感染組ACt值(PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)Ct/β-globin Ct值)除母體面的蛻膜細(xì)胞高于非感染組外其它均分別低于非感染組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.38,P=0.70；t=0.49,P=0.63；t=0.17,P=0.87；t=1.72,P=0.09)。 (2)胎盤(pán)HBV感染與新生兒血清HBsAg有關(guān)(χ2=4.88,P=0.03)而與新生兒HBV DNA無(wú)關(guān)(χ2=0.10,P=0.76)。將新生兒血清HBsAg、HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),胎盤(pán)HBV感染組的新生兒HBV宮內(nèi)感染率高于非胎盤(pán)HBV感染組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.71,P=0.10)。胎盤(pán)HBV感染與新生兒PBMC HBV DNA、PBMC HBV cccDNA均無(wú)關(guān)(χ2=1.89、0.76,P=0.17、0.38)。將新生兒血清HBsAg、HBV DNA及PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),胎盤(pán)HBV感染組的新生兒HBV宮內(nèi)感染率高于非胎盤(pán)HBV感染組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.09,P=0.15)。 3.胎盤(pán)細(xì)胞凋亡與HBsAg陽(yáng)性孕婦母-胎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及新生兒HBV感染的關(guān)系 (1)采用Tunel法檢測(cè)155例HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)的凋亡情況。胎盤(pán)細(xì)胞胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為凋亡陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)。從母體面至胎兒面的蛻膜細(xì)胞(DC)、滋養(yǎng)層細(xì)胞(TC)、絨毛間質(zhì)細(xì)胞(VMC)和絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VCEC)凋亡指數(shù)分別為4.5=3±0.07,5.56±0.06,4.66±0.05,4.05±0.06,合計(jì)胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù)為4.75±0.05。凋亡指數(shù)在HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)各層細(xì)胞上的分布總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F值為102.60,P=0.00),其中以滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡為主,絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡少見(jiàn)。采用SNK法進(jìn)--步比較胎盤(pán)各層細(xì)胞凋亡指數(shù),結(jié)果顯示：蛻膜細(xì)胞(DC)凋亡指數(shù)與滋養(yǎng)層細(xì)胞(TC)、絨毛毛細(xì)血.管內(nèi)皮細(xì)胞(VCEC)的凋亡指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05),DC的凋亡指數(shù)低于TC而高于VCEC;TC與DC、VMC及VCEC的凋亡指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TC的凋亡指數(shù)高于DC、VMC和VCEC;DC的凋亡指數(shù)低于VMC的凋亡指數(shù),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (2)發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.44,P=0.00)。發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)各層細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.86,P=0.01；t’=4.86,P=0.00；t=2.53,P=0.01;t=2.23,P=0.03)。 (3)將新生兒血清HBsAg、HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),宮內(nèi)感染組的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù)高于非宮內(nèi)感染組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.97,P=0.05)。將新生兒血清HBsAg、HBV DNA和/或PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),宮內(nèi)感染組的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù)高于非宮內(nèi)感染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.22,P=0.00)。 (4)新生兒外周血PBMC HBV DNA陽(yáng)性組的胎盤(pán)蛻膜細(xì)胞(DC)、滋養(yǎng)層細(xì)胞(TC)的凋亡指數(shù)高于陰性組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.08,P=0.04；t=3.47,P=0.00)。絨毛間質(zhì)細(xì)胞(VMC)、絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VCEC)的凋亡指數(shù)均高于陰性組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t’=0.92,P=0.36；t=0.77,P=0.44)。 (5)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)155例HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)Caspase3的表達(dá),胎盤(pán)細(xì)胞細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為Caspase3陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)。從母體面的蛻膜細(xì)胞至胎兒面的蛻膜細(xì)胞(DC)、滋養(yǎng)層細(xì)胞(TC)、絨毛間質(zhì)細(xì)胞(VMC)和絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VCEC)Caspase3陽(yáng)性表達(dá)的灰度值分別為98.40±1.86,82.05±1.39,86.41±1.57,89.10±1.70,合計(jì)胎盤(pán)Caspase3陽(yáng)性表達(dá)的灰度值為88.99±1.47；積分光密度值分別為15.58±0.33,18.59±0.29,17.67±0.31,17.31±0.35,合計(jì)胎盤(pán)Caspase3陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度值為17.29±0.29。Caspase3蛋白在HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)各層細(xì)胞上的分布總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F值分別為17.81、15.54,P值均小于0.05)。進(jìn)一步采用SNK法進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果顯示：蛻膜細(xì)胞(DC)Caspase3陽(yáng)性表達(dá)的灰度值與滋養(yǎng)層細(xì)胞(TC)、絨毛間質(zhì)細(xì)胞(VMC)和絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VCEC)的灰度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05),DC的Caspase3陽(yáng)性表達(dá)灰度值均高于TC、VMC和VCEC, TC的Caspase3灰度值最小,即TC凋亡率最高,其次VMC、VCEC,DC凋亡率最低；TC與VMC、VMC與VCEC的Caspase3陽(yáng)性表達(dá)的灰度值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DC Caspase3陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度值與TC、VMC和VCEC的積分光密度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,DC的Caspase3陽(yáng)性表達(dá)積分光密度值均低于TC、VMC和VCEC; TC Caspase3陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度值與DC、VMC和VCEC的積分光密度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TC的Caspase3陽(yáng)性表達(dá)積分光密度值均高于DC、VMC和VCEC,即TC凋亡率最高,其次VMC、VCEC,DC凋亡率最低：VMC與VCEC的Caspase3陽(yáng)性表達(dá)的灰度值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (6)發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組胎盤(pán)細(xì)胞Caspase3IHC灰度值低于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組的灰度值,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.80,P=0.01)；發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組胎盤(pán)細(xì)胞Caspase3IHC積分光密度值高于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.11,P=0.00)。發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)各層細(xì)胞Caspase3IHC灰度值均低于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.99,P=0.00；t=2.75,P=0.01；t=2.04,P=0.04;t=2.23,P=0.03)；發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)各層細(xì)胞Caspase3IHC積分光密度值均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.90,P=0.00；t=2.95,P=0.00;t=2.72,P=0.01；t=2.65,P=0.01)。 (7)將新生兒血清HBsAg、HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),宮內(nèi)感染組的胎盤(pán)細(xì)胞Caspase3IHC灰度值低于非宮內(nèi)感染組,積分光密度值高于非宮內(nèi)感染組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.02,P=0.31；t=1.04,P=0.30)。將新生兒血清HBsAg、HBV DNA和/或PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),宮內(nèi)感染組的胎盤(pán)細(xì)胞Caspase3IHC灰度值低于非宮內(nèi)感染組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.87,P=0.06)；積分光密度值高于非宮內(nèi)感染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.20,P=0.03)。 (8)新生兒外周血PBMC HBV DNA陽(yáng)性組的胎盤(pán)蛻膜細(xì)胞(DC)、絨毛間質(zhì)細(xì)胞(VMC)及絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VCEC)的Caspase3IHC灰度值均低于陰性組,積分光密度值均高于陰性組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.55,P=0.12；t=1.48,P=0.14;t=1.18,P=0.24；t=1.62,P=0.11；t=0.67,P=0.50；t=0.89,P=0.38)；新生兒PBMC HBV DNA陽(yáng)性組的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞(TC)的Caspase31HC灰度值低于陰性組,積分光密度值高于陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t’=2.71,P=0.01；t=2.33,P=0.02)。 (9)胎盤(pán)組織Caspase3mRNAACt值(CtCaspase3/CtGAPDH值)與胎盤(pán)組織凋亡指數(shù)(AI)、Caspase3免疫組化積分光密度值(iod)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.66,P=0.00；r=-0.18,P=0.03),與胎盤(pán)組織Caspase3免疫組化灰度值(gray)量止相關(guān)(r=0.23,P=0.00)。 (10)發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組胎盤(pán)組織Caspase3mRNA的△Ct值(CtCaspase3/CtGAPDH值)低于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組的△Ct值,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.86,P=0.00)。 (11)將新生兒血清HBsAg、HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),宮內(nèi)感染組的胎盤(pán)組織Caspase3mRNA的ACt值(CtCaspase3/CtGAPDH值)低于非宮內(nèi)感染組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.45,P=0.66)。將新生兒血清HBsAg、HBV DNA和/或PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),宮內(nèi)感染組的胎盤(pán)組織Caspase3mRNA的△Ct值(CtCaspase3/CtGAPDH值)低于非宮內(nèi)感染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.46,P=0.02)。 4.母-胎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及新生兒HBV感染的危險(xiǎn)因素研究 (1)母-胎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)危險(xiǎn)因素的分析：孕婦PBMC HBV DNA、胎盤(pán)蛻膜細(xì)胞Caspase3蛋白水平及胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)被引入回歸方程,OR值及95%CI分別為：14.60(5.61-38.00)、1.13(1.01-1.27)及4.09(1.898.85),且它們之間均存在交互作用(P值均0.05,OR95%CI不包括1)。 (2)新生兒PBMC HBV DNA陽(yáng)性危險(xiǎn)因素的分析：孕婦PBMC HBV DNA、PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)被引入回歸方程,OR值及95%CI分別為：41.21(11.13-152.64)、17.09(4.91-59.56),且兩因素間存在協(xié)同交互作用(P值0.05,OR95%CI不包括1)。 (3)新生兒PBMC HBV cccDNA陽(yáng)性危險(xiǎn)因素的分析：孕婦PBMC HBV cccDNA陽(yáng)性和胎盤(pán)凋亡指數(shù)被引入回歸方程,OR值及95%CI分別為：40.87(9.63-173.41)和0.21(0.07-0.62),兩因素間存在交互作用(P值0.05,OR95%Cl不包括1)。 (4)新生兒HBV宮內(nèi)感染危險(xiǎn)因素的分析：將新生兒血清HBsAg、HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行宮內(nèi)感染危險(xiǎn)因素的分析,孕婦HBeAg陽(yáng)性、分娩方式、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)和孕婦年齡被引入回歸方程,OR值及95%CI分別為：3.42(1.28-9.12)、0.33(0.12-0.95)、2.14(1.14-4.04)和0.87(0.77-0.99),交互作用分析顯示除分娩方式和胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)兩因素、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)和孕婦年齡兩因素間均無(wú)交互作用外(P值均0.05,OR95%CI不包括1),其它兩因素間均存在交互作用(P值均0.05,OR95%CI不包括1)；將新生兒血清HBsAg、HBV DNA和／或PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行宮內(nèi)感染危險(xiǎn)因素的分析,孕婦PBMC HBV DNA陽(yáng)性、PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)被引入回歸方程,OR值及95%CI分別為：6.95(2.71-17.82)、5.82(1.95-17.36)和2.56(1.33-4.91),交互作用分析顯示它們之間均存在交互作用(P值均0.05,OR95%CI不包括1)。 5.胎盤(pán)細(xì)胞凋亡在感染HBV的PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用 (1)86例新生兒PBMC中檢出20例HBsAg陽(yáng)性者,陽(yáng)性率為23.3%(20/86),即23.3%的新生兒發(fā)生PBMC HBV感染；31例GST陽(yáng)性者,陽(yáng)性率為36.0%(31/86),即36.0%的母兒發(fā)生了PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)；HBsAg、GST共存者13例,陽(yáng)性率為15.12%(13/86),即15.12%的母兒發(fā)生了感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn);發(fā)生PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)者中有41.94%(13/31)發(fā)生了感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)。 (2)發(fā)生PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)的新生兒發(fā)生PBMC HBsAg陽(yáng)性的危險(xiǎn)性是未發(fā)生PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)的新生兒的4.952,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.477,P=0.002)。 (3)發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t’=2.38,P=0.02)；且胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡率高與PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)(t=2.75,P=-0.01)。發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)Caspase3蛋白的表達(dá)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.23,P=0.82;t=0.98,P=0.33)。發(fā)生PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)組的胎盤(pán)Caspase3mRNA的表達(dá)低于未發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.59,P=0.12)。進(jìn)一步分析胎盤(pán)細(xì)胞凋亡與感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系,但未顯示感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)與胎盤(pán)細(xì)胞凋亡率高及胎盤(pán)Caspase3蛋白和mRNA的表達(dá)有關(guān)。 (4)新生兒PBMC HBsAg陽(yáng)性組的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù)低于陰性組的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡指數(shù),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.34,P=0.74)。新生兒PBMC HBsAg陽(yáng)性組的胎盤(pán)Caspase3蛋白的表達(dá)略高于陰性組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.01,P=0.99；t=0.07,P=0.95)。胎盤(pán)Caspase3mRNA的表達(dá)與新生兒PBMC HBsAg陽(yáng)性亦無(wú)關(guān)(t=0.22,P=0.83)。 6.胎盤(pán)細(xì)胞凋亡在PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中作用的體外研究 (1)5×106copies/ml的HBV陽(yáng)性血清刺激PBMC,共培養(yǎng)12h,24h和48hPBMC的細(xì)胞數(shù)不斷增加,共培養(yǎng)72h左右,細(xì)胞數(shù)減少。與HBV血.清共培養(yǎng)48h的PBMC發(fā)生HBV感染,而清洗細(xì)胞的洗液中未檢測(cè)出HBV DNA。 (2)在1μm孔徑的Transwell小室共培養(yǎng)模型中Bewo細(xì)胞被染上了綠色熒光提示感染HBV的PBMC與Bewo發(fā)生了融合。以8μmn孔徑的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移試驗(yàn),下室中檢測(cè)到標(biāo)有綠色熒光的PBMC。 (3) Bewo與HBV血清和感染HBV的PBMC共培養(yǎng)0h、12h、24h、48h,Bewo+HBV感染組和Bewo+感染HBV的PBMC共培養(yǎng)組的早期凋亡率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在共培養(yǎng)Oh、12h,Bewo+HBV感染組和Bewo+感染HBV的PBMC共培養(yǎng)組,Bewo總凋亡率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但共培養(yǎng)24h、48h,Bewo+HBV感染組總凋亡率與同期的對(duì)照組和Bewo+感染HBV的PBMC共培養(yǎng)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。分別對(duì)同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的早期和晚期凋亡率進(jìn)行比較,各組中不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),凋亡率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),到48h時(shí)HBV感染組總凋亡率達(dá)到最高。 (4)感染HBV的PBMC與Bewo共培養(yǎng)組不同的時(shí)間點(diǎn)Bewo細(xì)胞Caspase3mRNA的表達(dá)量比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.114,P=0.002),且各組間兩兩比較后,除12h與0hCaspase3mRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異外,其他各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在24h和48h組中,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)Caspase3mRNA的相對(duì)表達(dá)量有升高的趨勢(shì)。 (5)感染HBV的PBMC與Bewo細(xì)胞共培養(yǎng)48h時(shí),收集下室的PBMC,其HBV DNA拷貝數(shù)為(2.565±0.361)×103copies/ml,同時(shí),在此時(shí)間點(diǎn)HBV cccDNA的拷貝數(shù)為(1.3550±2.473)×103copies/ml,按判斷標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA拷貝數(shù)≥103copies/ml為陽(yáng)性,HBVcccDNA拷貝數(shù)≥102copies/ml為陽(yáng)性提示此時(shí)間點(diǎn)下室中的PBMC發(fā)生感染,且HBV發(fā)生復(fù)制。 結(jié)論1.將新生兒血清HBsAg、HBV DNA及PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒宮內(nèi)感染的指標(biāo),即若將新生兒PBMC HBV DNA引入作為宮內(nèi)感染的判定指標(biāo),PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)與新生兒HBV宮內(nèi)感染有關(guān)。 2.胎盤(pán)HBsAg陽(yáng)性與新生兒血清HBsAg有關(guān),而與宮內(nèi)感染無(wú)關(guān)。 3.胎盤(pán)各層細(xì)胞均發(fā)生凋亡,以滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡為主。胎盤(pán)細(xì)胞凋亡增加與PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。將新生兒血清HBsAg、HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),胎盤(pán)細(xì)胞凋亡與宮內(nèi)感染無(wú)關(guān)。將新生兒血清HBsAg、HBV DNA和/或PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn),胎盤(pán)細(xì)胞凋亡則與宮內(nèi)感染有關(guān)。滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡與新生兒PBMC HBV DNA有關(guān)。 4.孕婦PBMC HBV DNA、胎盤(pán)蛻膜細(xì)胞Caspase3蛋白表達(dá)及胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)是母-胎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的危險(xiǎn)因素；孕婦PBMC HBV DNA、PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)是新生兒PBMC HBVDNA陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素；孕婦PBMC HBV cccDNA陽(yáng)性是新生兒PBMC HBV cccDNA陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素,胎盤(pán)凋亡指數(shù)是新生兒PBMC HBV cccDNA的保護(hù)因素；將新生兒血清HBsAg、HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行宮內(nèi)感染危險(xiǎn)因素的分析,孕婦HBeAg陽(yáng)性和胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)是危險(xiǎn)因素,而剖宮產(chǎn)和孕婦年齡是保護(hù)因素；將新生兒血清HBsAg、HBV DNA和/或PBMC HBV DNA任一項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷新生兒HBV宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行宮內(nèi)感染危險(xiǎn)因素的分析,孕婦PBMC HBV DNA陽(yáng)性、PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)及胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)是危險(xiǎn)因素。 5.以檢測(cè)PBMC中HBsAg作為PBMC HBV感染的指標(biāo)時(shí),未顯示感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)與胎盤(pán)細(xì)胞凋亡有關(guān)。PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)與新生兒PBMC HBsAg有關(guān)。胎盤(pán)細(xì)胞凋亡與新生兒PBMC HBsAg無(wú)關(guān)。 6.新生兒PBMC HBV DNA陽(yáng)性可作為HBV宮內(nèi)感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。PBMC可以作為HBV的載體從母體轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒血循環(huán)造成胎兒感染,PBMC母-胎轉(zhuǎn)運(yùn)可能是HBV宮內(nèi)感染的另一條感染途徑。 7.體外模擬胎盤(pán)屏障研究胎盤(pán)細(xì)胞凋亡和感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系,結(jié)果顯示胎盤(pán)凋亡率與感染HBV的PBMC的遷移率正相關(guān),且感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)至Transwell下室后,可感染下室的PBMC,推論若感染HBV的母親PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒血循環(huán)會(huì)造成胎兒PBMC HBV感染。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2762832