【摘要】：隨著非酒精性脂肪肝病(NAFLD)發(fā)病率逐年上升,已成為21世紀全球重要的公共健康問題之一,探究其病理機制和發(fā)掘潛在治療靶點是目前相關(guān)研究的重心。金屬離子在細胞功能、信號轉(zhuǎn)導和能量代謝中起到重要作用,參與多種生理活動和疾病發(fā)展,是許多脂代謝關(guān)鍵酶的輔基,但它們在NAFLD脂代謝中的調(diào)控作用并不完全清楚。三價鉻離子是哺乳動物必需微量元素之一,在維持血糖平衡和脂質(zhì)代謝中起著重要作用,廣泛應用于保健品、飼料添加劑和醫(yī)藥行業(yè)。有報道其對預防和緩解NAFLD有潛在作用,但分子機制仍不清晰。首先選取SMMC-7721細胞和BALB/c小鼠作為研究對象,用油酸(OA)作為單一外源脂肪酸誘導構(gòu)建NAFLD細胞模型和小鼠模型,并對NAFLD模型補充三價鉻離子。結(jié)果顯示三價鉻離子可以有效改善NAFLD性狀。三價鉻離子可以有效降低肝細胞和肝臟內(nèi)甘油三酯和脂肪酸的過量累積,降低肝重、體重和轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST含量,降低CD36和DGAT2的過表達,同時穩(wěn)定小鼠血清中紊亂的炎癥因子。在和DGAT2抑制劑、激動劑聯(lián)合作用時,三價鉻離子依然對DGAT2的表達水平起負調(diào)控效應,抑制甘油三酯的合成,說明DGAT2可能是三價鉻離子參與NAFLD脂代謝調(diào)控的重要靶分子。對OA誘導的NAFLD細胞模型和小鼠模型進行金屬組分析發(fā)現(xiàn),脂變性的同時均伴隨著鎂缺乏,外源補充鎂離子NAFLD脂代謝紊亂能否得到改善有待證實。鎂離子是人體內(nèi)第二大陽離子,作為輔酶因子參與細胞內(nèi)600多種酶系統(tǒng),在能量代謝、細胞增殖和神經(jīng)傳導中有著重要作用,而鎂缺乏會造成痙攣、抑郁、高血脂和肥胖等疾病。本文結(jié)果顯示補充鎂離子可以有效緩解NAFLD模型的脂變性:通過油紅O染色、TLC和GCMS等方法檢測脂類變化發(fā)現(xiàn)外源鎂離子可以緩解NAFLD模型中甘油三酯以及脂肪酸的過量累積;且外源鎂離子可以抑制NAFLD小鼠血清中過高的轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST;進一步通過實時熒光定量PCR和Western blot分析相關(guān)脂代謝基因發(fā)現(xiàn)外源鎂離子可以降低OA引起的CD36和DGAT2過量表達,推測鎂離子通過降低脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36表達來降低肝臟攝取OA,同時通過降低甘油三酯合成限速酶DGAT2表達來降低肝臟內(nèi)甘油三酯合成。已有研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子紊亂可以導致并加重NAFLD發(fā)病程度,促炎因子和抗炎因子之間的平衡,可能決定了 NAFLD的進展,本文通過ELISA分析NAFLD小鼠血清炎癥因子變化,結(jié)果顯示鎂離子可以降低促炎因子(IL-1β、TNF-α和IL-12)含量并升高抗炎因子(IL-10)含量,改善NAFLD小鼠炎癥反應。此外,用ICP-AES檢測NAFLD細胞和小鼠模型金屬組,結(jié)果顯示外源鎂離子可以有效緩解NAFLD模型鐵負載癥狀,說明鎂離子可以通過改善鐵負載進而起到改善NAFLD的性狀。鎂離子對NAFLD緩解作用機制研究表明,外源OA下調(diào)了 NAFLD細胞模型鎂離子轉(zhuǎn)運基因PRL3和CNNM3的表達水平,同時降低肝細胞內(nèi)鎂離子濃度;相反,通過重組質(zhì)粒超表達PRL3和CNNM3可以恢復胞內(nèi)鎂離子含量,且PRL3響應鎂離子對DGAT2的調(diào)控。鎂離子響應基因PRL3是否可以通過調(diào)控DGAT2的表達影響甘油三醋合成?本文利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾技術(shù)對通路上各信號蛋白進行超表達或沉默,結(jié)果表明PRL3作為上游基因作用于PI3K/AKT/mTOR和mTOR/Lipin1/SREBP1信號通路,且SREBP1調(diào)控DGAT2的表達。在鎂離子緩解NAFLD細胞模型脂積累同時,添加PRL3抑制劑和mTOR抑制劑進行驗證,Western blot結(jié)果表明鎂離子經(jīng)由PRL3/AKT/mTOR和mTOR/Lipin1/SREBP1作用于DGAT2的表達,并經(jīng)由此通路影響甘油三酯的合成。SREBP1作為脂代謝基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域克隆超表達載體可以下調(diào)DGAT2表達,且siRNA-SREBP1上調(diào)DGAT2表達。啟動子數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)DGAT2啟動子區(qū)域存在SREBP1結(jié)合位點(5'-ATCACCCCAC-3'),熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)SREBP1負調(diào)控DGAT2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性,EMSA和ChIP實驗結(jié)果證實SREBP1蛋白和DGAT2啟動子DNA在細胞外和內(nèi)存在結(jié)合作用。同時鎂離子作為輔助因子參與SREBP1蛋白和DGAT2啟動子的結(jié)合過程。綜上所述,三價鉻離子和鎂離子均可以降低OA誘導的NAFLD小鼠模型中的脂累積、肝重、體重和轉(zhuǎn)氨酶,并穩(wěn)定紊亂的脂代謝基因和炎癥因子;鎂離子還起到改善鐵負載和鎂缺乏的作用。鎂離子參與NAFLD脂代謝細胞調(diào)控機制結(jié)果顯示:鎂離子經(jīng)由PRL3/AKT/mTOR 和 mTOR/Lipin1/SREBP1 通路作用于 DGAT2 的表達且參與 SREBP1對DGAT2轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程�？傊�,通過本論文的研究,證實了金屬離子在NAFLD脂代謝的重要調(diào)控作用,并提出了DGAT2作為NAFLD潛在治療靶點的可能性。
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575
【圖文】：

肪性肝炎的發(fā)病過程［１７］。胰島素抵抗引起肝臟內(nèi)過量甘油三酯累積和脂變性是第一次打逡逑擊，隨后的脂質(zhì)過氧化、氧化應激和炎癥因子等構(gòu)成了第二次打擊［１８］。雖然該假說中很逡逑多問題仍未解決，但是提供了一個有力的理論體系去理解ＮＡＦＬＤ發(fā)病機制，如圖１．１逡逑所示。逡逑Ａｄｉｐｏｓｅ邋ｔｉｓｓｕｅ邐邐逡逑、、邐Ｎｏｒｍａｌ邋Ｌｉｖｅｒ逡逑_炲澹罰劍潁耍蟈邋五義希桑睿螅酰歟椋鑠澹潁澹螅椋螅簦幔睿悖邋義媳觥義希齲歟埃耍睿澹簀義希蓿牛悖澹螅螅椋觶邋澹媯幔歟戾危鄭洛義希保澹祝耍蟈義賢跡保卞澹危粒疲蹋膩濉岸未蚧鰲奔偎擔郟保梗蒎義希疲椋紓澹保卞澹齲穡錚簦瑁澹螅椋簀澹錚駑濉埃裕鰨镥澹齲椋簦蟆卞澹椋鑠澹危粒疲蹋膩義轄┠暄芯糠⑾只褂釁淥蛩乜梢緣賈攏危粒疲蹋姆⒉�，包括肥艓淫o核氐摯埂⒉誨義狹忌釹骯咭誠骯�、父C撞《盡⒊Φ牢⑸锏奈陜乙約跋喙刂虜』蟣澩锏齲郟玻牽蕁＞」苠義隙裕危粒疲蹋姆⒉』譜雋舜罅墾繡常賾詡膊〉牟∫蠔頭腫踴迫勻鮮隊邢�，需要进辶x弦徊繳釗胙芯俊ｅ義希保保沖澹危粒疲蹋鬧瘟蒲繡辰瑰義锨岫戎湫緣模危粒疲蹋幕頰呤強梢宰勻荒孀�，通过簜b淼囊車髡陀行У奶迥苠義隙土犢梢愿納聘臥嘀凈郟郟玻保蕁９靠防鍔閎�，矄决容易蒂Z路逝鄭一崽岣呋煎義希危粒疲蹋牡姆縵�，哉浕庚Z中艿乃婊匝櫓校蛔櫓駒剛吒嚀且�，另一组竾撉饮辶x鮮澈笤儼鉤涓嚦防锪閌常笳呋崦饗猿魷指共恐糾芻透臥嘀湫裕郟玻玻蕁Ｏ嚳吹眉詞瑰義顯諉揮刑迥芏土兜那榭魷攏拗埔襯芰康納閎�，血液中的转氨酶、肝伕胞质榔c�、肝辶x顯嘌字⒎從拖宋薊嵊忻饗愿納疲保玻常ァ＝仙俚腦碩勘熱緋な奔渚米

本文編號：2762772