【摘要】：目的:觀察腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)情況下,共培養(yǎng)體系中BMSCs對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSCs)凋亡的影響,探討TNF-α刺激的BMSCs誘導(dǎo)HSCs凋亡的機(jī)制。 方法:貼壁篩選法培養(yǎng)、純化SD大鼠BMSCs,傳代至第3-6代使用,大鼠HSCs細(xì)胞系及纖維原細(xì)胞系凍融后傳代使用。在半透膜(transwell insert)上接種HSCs,在6孔塑料培養(yǎng)板上接種BMSCs,建立上下共培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)分6組:①HSCs空白對(duì)照組:單獨(dú)HSCs培養(yǎng);②HSCs陰性對(duì)照組:纖維原細(xì)胞+HSCs共培養(yǎng);③BMSCs空白對(duì)照組:單獨(dú)BMSCs培養(yǎng);④BMSCs刺激培養(yǎng)組:BMSCs+TNF-α培養(yǎng);⑤正常共培養(yǎng)組:BMSCs+HSCs共培養(yǎng);⑥刺激共培養(yǎng)組:BMSCs+TNF-α+HSCs共培養(yǎng)。培養(yǎng)觀察24h、48h,各時(shí)間段在倒置相差顯微鏡下觀察HSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;免疫組化法檢測(cè)HSCsα-SMA表達(dá);MTT檢測(cè)HGF對(duì)HSCs增殖抑制率;流式細(xì)胞儀Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測(cè)HSCs凋亡率;RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)HSCs RhoA mRNA和蛋白以及BMSCs HGF mRNA和蛋白表達(dá);收集培養(yǎng)體系上清液,ELISA測(cè)定上清液中HGF的表達(dá)。 結(jié)果:1.HGF單獨(dú)刺激HSCs無(wú)明顯增殖抑制作用,與HSCs空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.兩組共培養(yǎng)組HSCs凋亡率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增加,刺激共培養(yǎng)組(24,48 h: 6.583±0.091%,29.960±0.223%)與正常共培養(yǎng)組(24,48 h: 4.700±0.168%,23.140±0.115%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)。3.兩組共培養(yǎng)組HSCs RhoA蛋白及mRNA的表達(dá)呈時(shí)間依賴性下降,與HSCs空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);刺激共培養(yǎng)組與正常共培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01);兩組共培養(yǎng)組BMSCs HGF蛋白及mRNA的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加,與BMSCs空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01),刺激共培養(yǎng)組與正常共培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05);BMSCs刺激培養(yǎng)組HGF蛋白及mRNA的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加,與BMSCs空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)。4.ELISA測(cè)定上清液結(jié)果顯示:HSCs自分泌HGF,24h時(shí)段分泌量(34.573±0.071 ng/ml)高于48h時(shí)段(21.733±0.133 ng/ml);BMSCs自分泌HGF,48h時(shí)段分泌量高于24h時(shí)段,BMSCs刺激培養(yǎng)組HGF分泌量[24,48 h:(18.791±0.080),(25.123±0.074) ng/ml) ]高于BMSCs空白對(duì)照組[24,48 h:(14.16±0.11),(18.19±0.12)ng/ml](P 0.01);刺激共培養(yǎng)組[24,48 h:(13.917±0.070), (11.420±0.036) ng/ml]在相應(yīng)時(shí)段HGF的分泌量高于正常共培養(yǎng)組[24,48 h:( 11.897±0.045),( 11.297±0.031) ng/ml],兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)。 結(jié)論: HSCs與BMSCs共培養(yǎng)上調(diào)BMSCs HGF的表達(dá),抑制HSCs RhoA表達(dá),促進(jìn)HSCs的凋亡,TNF-α刺激BMSCs后共培養(yǎng)增強(qiáng)了這些作用;通過(guò)旁分泌HGF及其它因子的協(xié)同作用途徑,可能是BMSCs促進(jìn)HSCs凋亡和抑制RhoA表達(dá)的機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.2
【圖文】：

圖 1-5 第 3 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記的流式結(jié)果Fig 1-5 Flow cytometry results of P3 BMSCs surface markers形態(tài)及 a-SMA 的表達(dá) (圖 2-1～圖 2-4）細(xì)胞 12 培養(yǎng)小時(shí)，在培養(yǎng)瓶中完全帖壁生長(zhǎng)，呈圓形或細(xì)胞變長(zhǎng)且分裂增殖，呈纖維樣細(xì)胞形狀，細(xì)胞核分裂相后的星狀細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，48 小時(shí)成典型的成纖維細(xì)胞化學(xué)染色顯示,培養(yǎng) 48 小時(shí) HSC 的 a-SMA 表達(dá)呈陽(yáng)性，并成棕色細(xì)條索狀。HSC 呈星形，胞體大，呈片狀伸展，偽性表達(dá)率 95%以上。

圖 2-3 HSCs a-SMA 免疫組化(50×) 圖 2-4 HSCs a-SMA 免疫組化(100×)Fig 2-3 immunohistochemisty of a-SMA Fig 2-4 immunohistochemisty of a-SMAin HSCs (50×) in HSCs (100×)3. 纖維原細(xì)胞相差顯微鏡下觀察（圖 3-1, 圖 3-2）纖維原細(xì)胞12小時(shí)后在培養(yǎng)瓶中完全帖壁生長(zhǎng)各組成纖維細(xì)胞形態(tài)基本相似，呈梭形或不規(guī)則三角形，放射狀或旋渦狀走行。圖 3-1 纖維原細(xì)胞 (50×) 圖 3-2 纖維原細(xì)胞(100×)Fig 3-1 fibroblast cells (50×) Fig 3-2 fibroblast cells(100×)

圖 2-3 HSCs a-SMA 免疫組化(50×) 圖 2-4 HSCs a-SMA 免疫組化(100×)Fig 2-3 immunohistochemisty of a-SMA Fig 2-4 immunohistochemisty of a-SMAin HSCs (50×) in HSCs (100×)3. 纖維原細(xì)胞相差顯微鏡下觀察（圖 3-1, 圖 3-2）纖維原細(xì)胞12小時(shí)后在培養(yǎng)瓶中完全帖壁生長(zhǎng)各組成纖維細(xì)胞形態(tài)基本相似，呈梭形或不規(guī)則三角形，放射狀或旋渦狀走行。圖 3-1 纖維原細(xì)胞 (50×) 圖 3-2 纖維原細(xì)胞(100×)Fig 3-1 fibroblast cells (50×) Fig 3-2 fibroblast cells(100×)

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡昆鵬;林楠;林繼宗;鄧美海;湯照峰;項(xiàng)鵬;許瑞云;;人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞的體外調(diào)控[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年27期

2 蘇思標(biāo);姜海行;王東旭;覃山羽;梁梓宇;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控肝星狀細(xì)胞RhoA、P27的表達(dá)[J];世界華人消化雜志;2009年32期

3 陳國(guó)忠;姜海行;陸正峰;肖健;梁梓宇;覃山羽;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡和RohA表達(dá)的調(diào)控[J];世界華人消化雜志;2010年16期

本文編號(hào)：2762293