【摘要】： 目的:通過本研究探討TNF-α對肝細胞脂肪變性模型固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)及固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)表達的影響,探討TNF-α在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)SCAP-SREBP-1c脂質合成通路中的作用及可能機制。 方法: 1、建立油酸誘導的人肝細胞脂肪變性模型。 2、正常成人L-02肝細胞株,用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng),分為對照組和模型組,正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為對照組(簡稱C組),正常培養(yǎng)基加油酸誘導培養(yǎng)的細胞為模型組(簡稱F組),另外兩組加入TNF-α(C組+TNF-α,簡稱C1組;F組+TNF-α,簡稱F1組)。TNF-α終濃度為200ng/mL。 3、油紅0染色光學顯微鏡觀察肝細胞脂滴積聚的情況。 4、RT-PCR法檢測各組SCAP、SREBP-1c、FAS mRNA表達變化。 5、Western blot法檢測各組SCAP、SREBP-1c蛋白表達變化。 6、采用酶底物結合反應檢測肝細胞FAS活性變化。 7、檢測各組肝細胞內(nèi)甘油三酯(TG)的含量。 結果: 1、成功地建立了油酸誘導的L-02肝細胞株脂肪變性模型。油紅0染色光學顯微鏡觀察對照組細胞內(nèi)未見紅色脂滴。模型組在培養(yǎng)24小時后細胞內(nèi)即可見少量脂肪變細胞,72小時可見細胞質內(nèi)聚集了較多橘紅色的脂滴。電鏡觀察對照組細胞質內(nèi)偶見脂滴出現(xiàn)。模型組肝細胞體積較大,較多脂滴存在于胞質中;核膜迂曲輪廓不清;細胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少,基質腫脹,嵴稀疏。 2、油紅0染色光學顯微鏡觀察C組未見肝細胞脂肪變,細胞排列緊密,邊緣清晰,細胞核清晰可見。C1組可見少量脂肪變細胞,F組可見大量脂肪變細胞,F1組脂變細胞最多,細胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增多,部分融合成較大的脂滴,將細胞核推擠于一側。 3、各組肝細胞SCAP、SREBP-1c、FAS mRNA表達的比較:C1、F、F1組較對照組增高(P＜0.01),F1組增加最顯著。C1組與C組比較、F1組與F組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 4、SCAP、SREBP-1c蛋白的表達與mRNA表達變化規(guī)律一致。 5、FAS活性的比較:C1、F、F1組較C組增高(P＜0.01),其中F1組最高。C1組與C組比較、F1組與F組比較差異有顯著意義(P＜0.01),但F1組增加更明顯。 6、肝細胞內(nèi)TG含量的比較:C1、F、F1組較C組增高(P＜0.01),其中F1組最高。C1組與C組比較、F1組與F組比較差異有顯著意義(P＜0.01),但F1組增加更明顯,表明TNF-α對C組、F組均有作用,但對F組作用更明顯。 結論: 1、采用L-02肝細胞株可以成功制作培養(yǎng)的肝細胞脂肪變性模型。 2、TNF-α可上調(diào)正常L-02肝細胞及脂肪變性肝細胞SCAP、SREBP-1c、FAS的表達,促進肝細胞內(nèi)TG的合成與蓄積。 3、TNF-α作用于正常肝細胞時,少數(shù)肝細胞也可發(fā)生脂肪變性,當作用于模型組時,發(fā)生脂肪變性的肝細胞數(shù)量較前明顯增加,細胞內(nèi)TG含量也顯著增加。TNF-α在脂肪變性的肝細胞更能促進SCAP、SREBP-1c的表達,因此TNF-α除可直接影響肝細胞脂代謝以外,還是加重脂肪變性肝細胞脂代謝紊亂的重要因素。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R575
【圖文】：

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.C組.F組S班Br一leSCAP、SREBP一lc蛋白表達的變化CAp蛋白的表達較C組增高(p<0.01)，F(xiàn)I組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但Fl增強更明顯，對F組作用更明顯(見圖14和表10)。

圖15westernblot顯示SREBP一le蛋白的表達組肝細胞seAP、s咫BP一l。蛋白表達westernblot結果C組CI組F組8.30士13.24256.34士11.47*413.5士32.97*24.30士6.37346.41士15.16*603.4土54.82*較;#:尸<0.01，與F組比較1600140012001000800600400

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