【摘要】：[背景]便秘是全球性的常見病和慢性病,已成為影響人們身心健康和生活質(zhì)量的重要因素之一。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),便秘的癥狀和發(fā)病均存在明顯的性別相關(guān)性,女性的癥狀更嚴(yán)重、發(fā)病率更高,提示雌激素可能在便秘的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。此外,動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌激素可使大鼠結(jié)腸擴(kuò)張,離體肌條實(shí)驗(yàn)也證實(shí)雌激素可抑制人結(jié)腸平滑肌收縮,其機(jī)制尚未完全明確。離子通道是影響胃腸運(yùn)動的關(guān)鍵因素之一,目前小電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道(small conductance Ca2+ activated K+ channels, SK)的作用倍受關(guān)注,它是一種Ca2+高敏感性、非電壓依賴性的選擇性K+通道,可參與抑制結(jié)腸平滑肌收縮作用。在中樞神經(jīng)元、子宮平滑肌細(xì)胞等研究中發(fā)現(xiàn),雌激素不僅直接影響SK通道的功能,還影響其表達(dá)。但SK通道是否介導(dǎo)了雌激素(17p-雌二醇)對結(jié)腸平滑肌的舒張作用仍不清楚。[目的]1.探討SK通道在17p-雌二醇(17p-estradiol, E2)抑制大鼠結(jié)腸平滑肌收縮中的作用。2.探討E2對大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells, SMCs)上SK3表達(dá)的影響及機(jī)制。[方法]1.取雄性成年SD大鼠結(jié)腸制備肌條(1)E2和SK通道阻斷劑對卡巴膽堿(carbachol, CCh)誘導(dǎo)的結(jié)腸收縮的影響：CCh刺激結(jié)腸平滑肌肌條產(chǎn)生瞬時收縮后,分別給予溶劑DMSO、E2和SK通道阻斷劑蜂毒明肽,觀察各自對肌條收縮的影響。(2)SK通道阻后,E2對結(jié)腸收縮的影響：CCh刺激肌條產(chǎn)生瞬時收縮后,立即予蜂毒明肽預(yù)處理10 min,再加E2刺激,觀察肌條收縮情況。2.酶解法分離培養(yǎng)雄性成年SD大鼠結(jié)腸SMCs(1)檢測SK通道在大鼠結(jié)腸SMCs中的表達(dá)：①免疫熒光雙標(biāo)法觀察SK2.SK3與a-Actin共表達(dá)情況；② qRT-PCR檢測SK2、SK3的基因表達(dá)情況。(2)E2對大鼠結(jié)腸SMCs上SK3表達(dá)的影響：以不同濃度和不同時間E2刺激SMCs后,以qRT-PCR、Western blot分別檢測SMCs上SK3的mRNA和蛋白水平。(3)雌激素核受體在E2調(diào)節(jié)SK3表達(dá)中的作用：分別給予E2、雌激素受體拈抗劑(ICI 182780)以及BSA結(jié)合的E2)BSA-E2,非細(xì)胞膜通透性)刺激SMCs,用Western blot檢測SK3的蛋白水平。(4)雌激素Ⅸ受體在E2調(diào)節(jié)SK3表達(dá)中的作用：分別給予E2、α受體激動劑(PPT)及p受體激動劑(DPN)刺激SMCs,用Western blot檢測SK3的蛋白水平。[結(jié)果]1.與溶劑DMSO組比,E2刺激后肌條張力迅速降低(P=0.019)；而給予SK通道阻斷劑蜂毒明肽后,肌條張力迅速增加(P=0.047)2.蜂毒明肽預(yù)處理后再加E2刺激,肌條的收縮張力較DMSO組明顯降低(P=0.014),但仍顯著高于E2組(P=0.026)3.細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)顯示大鼠結(jié)腸SMCs上SK2、SK3均與a-Actin共表達(dá),且在SMCs內(nèi),SK3 mRNA表達(dá)水平高于SK2 mRNA水平(P=0.021)。4.E2可促進(jìn)體外培養(yǎng)的SMCs上SK3 mRNA和蛋白表達(dá),50 nmol/L是最大有效濃度(P0.05);在E2作用下,SK3表達(dá)的高峰時間為第12 h和24 h(P0.05)。5.予ICI 182780預(yù)處理后加入E2,SK3蛋白表達(dá)顯著低于E2組(P0.05),而BSA-E2對SK3的表達(dá)無影響。6.α受體激動劑PPT可顯著促進(jìn)SK3表達(dá)(P0.05),作用基本與E2一致；p受體激動劑DPN對SK3無影響。[結(jié)論]1.E2抑制大鼠結(jié)腸環(huán)肌收縮的作用,部分通過激活蜂毒明肽敏感的SK通道完成。2.大鼠結(jié)腸SMCs上存在SK2、SK3,且SK3的mRNA水平高于SK2。3.體外E2刺激能上調(diào)大鼠結(jié)腸SMCs內(nèi)SK3表達(dá),該作用通過ERα完成。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R574.62
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果一、E2 及蜂毒明肽對 CCh 誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸環(huán)肌收縮的影響10-4mol/L CCh 致大鼠結(jié)腸環(huán)肌收縮達(dá)最大值后，與空白對照組相比，0.1%DMSO 刺激，肌條張力無明顯變化（數(shù)據(jù)未給出）。由于各肌條間收縮變化差異大，結(jié)果均以占 CCh 誘導(dǎo)最大收縮值的百分比表示。發(fā)現(xiàn)與溶劑 DMSO 組比，1 μmol/L E2 刺激使肌條收縮張力迅速降低（50.68% ± 24.78% vs 7.29% ± 4.65%，P=0.019）；而給予 1 μmol/L SK 通道阻斷劑蜂毒明肽后，肌條收縮張力迅速增加（50.68% ± 24.78% vs 84.67% ± 14.28%，P=0.047）（見圖 1）。證實(shí) E2、激活的 SK 通道均可抑制大鼠結(jié)腸環(huán)肌收縮。

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文二、蜂毒明肽在 E2 抑制大鼠結(jié)腸環(huán)肌收縮中的作用為明確 SK 通道是否參與 E2 抑制大鼠結(jié)腸環(huán)肌收縮的過程，在 CCh 致肌條收縮達(dá)最大值后，先予 SK 通道阻斷劑蜂毒明肽預(yù)處理 10 min，再加 E2 刺激，肌條的收縮張力較溶劑 DMSO 組降低（30.95% ± 4.09% vs 58.64% ± 16.19%，P=0.014），但仍顯著高于 E2 組（30.95% ±4.09% vs 6.97% ± 4.37%，P=0.026）（見圖 2）。提示 E2 抑制大鼠結(jié)腸環(huán)肌收縮的作用部分是通過蜂毒明肽敏感的SK 通道完成的。

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果一、SK 通道在大鼠結(jié)腸 SMCs 的表達(dá)文獻(xiàn)報(bào)道，SK 家族的 3 個亞型在胃腸道分布不一，SK1 表達(dá)極弱，SK2 和SK3 則分布較廣[4, 5]。因此對培養(yǎng)的結(jié)腸 SMCs 進(jìn)行 SK2、SK3 與 α-Actin 的免疫熒光雙標(biāo)，顯示：α-Actin 熒光反應(yīng)陽性（大部分細(xì)胞漿內(nèi)見紅色熒光），SK2、SK3 也分別呈陽性反應(yīng)（綠色熒光），細(xì)胞核 Hoechst 染色呈藍(lán)色，即 SK2、SK3分別與 α-Actin 存在共表達(dá)（圖 1A，B）。提示培養(yǎng)的細(xì)胞為 SMCs，且該大鼠結(jié)腸 SMCs 表達(dá) SK2、SK3。將 SMCs 提取 RNA，分別對 SK2 和 SK3 進(jìn)行 qRT-PCR，發(fā)現(xiàn) SK3 mRNA水平明顯高于 SK2 mRNA 水平（0.951 ± 0.103 vs 0.690 ± 0.331；P=0.021）（圖1C）。

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本文編號：2761595