發(fā)布時(shí)間：2020-07-18 23:46

【摘要】：背景與目的:膽汁淤積即膽汁生成或排泌發(fā)生障礙,膽汁酸在肝內(nèi)積聚使肝細(xì)胞暴露于持續(xù)升高的膽汁酸中,最終導(dǎo)致肝損傷、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞損傷引發(fā)肝鄰近細(xì)胞(枯否細(xì)胞的激活、肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSCs)以及其他炎性細(xì)胞)的招募和活化,持久反復(fù)的肝星狀細(xì)胞的激活引起以廣泛瘢痕形成以及肝結(jié)構(gòu)和功能紊亂為特征的肝纖維化、肝硬化。一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,2010年全球由于肝硬化引起死亡的人數(shù)已經(jīng)超過(guò)1百萬(wàn)。因此,肝硬化是全球健康醫(yī)療系統(tǒng)的一個(gè)極大負(fù)擔(dān),絕大多數(shù)的肝硬化只能被控制,并不能被治愈。因此,找到新的危險(xiǎn)因素以及可能的治療靶點(diǎn)對(duì)于防治肝硬化以及藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義。膽汁淤積是終末期肝硬化普遍的病理生理狀態(tài),以往研究表明膽汁酸與肝硬化的進(jìn)展有關(guān)。我們團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)某些特定膽汁酸的組成在肝硬化患者中發(fā)生改變。本課題組前期通過(guò)超高相液相色譜質(zhì)譜連用儀(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)檢測(cè)了32名肝硬化患者以及27名健康志愿者的12種血清膽汁酸的濃度,結(jié)果顯示�；悄懰�(Taurocholic acid,TCA)、甘氨膽酸(Glycocholic acid,GCA)、�；敲撗跄懰�(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)發(fā)生顯著改變,這三種差異膽汁酸在肝硬化患者血清中明顯增加,其中TCA升高最顯著。此外,肝硬化患者血清TCA水平與肝硬化嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)指標(biāo)------Child-Pugh正相關(guān)。然而這些特定膽汁酸在促進(jìn)肝硬化的機(jī)制并不清楚,因此,本研究通過(guò)細(xì)胞及分子學(xué)研究模擬肝硬化狀態(tài)下的體內(nèi)微環(huán)境,旨在探究TCA對(duì)肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制。材料與方法:肝星狀細(xì)胞系LX-2以及肝細(xì)胞系HepG2的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用來(lái)探究�；悄懰釋�(duì)肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制。分別對(duì)LX-2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞以及Tranwell共培養(yǎng)的兩種細(xì)胞給予病理濃度的TCA干預(yù),細(xì)胞毒性及增殖實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)以及ELISA實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)TCA對(duì)肝細(xì)胞毒性作用、炎癥相關(guān)指標(biāo)血紅素氧合酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)的表達(dá)、肝星狀細(xì)胞增殖指標(biāo)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、一型膠原(type I collagen,CoI1A1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transformed growth factorβ,TGFβ1)以及TLR4、HO-1水平。結(jié)果1.相比對(duì)照組,病理濃度下的TCA并沒(méi)有對(duì)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,而TCA促進(jìn)LX-2細(xì)胞增殖。2.相比對(duì)照組,50μM、100μM TCA干預(yù)HepG2細(xì)胞后,TLR4的表達(dá)顯著增加,HepG2細(xì)胞的HO-1表達(dá)水平也被TCA顯著誘導(dǎo)。3.LX-2細(xì)胞被TCA干預(yù)后,CoI1A1、α-SMA、HO-1以及TLR4的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加。這些結(jié)果預(yù)示TCA促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖可能通過(guò)上調(diào)TLR4/HO-1信號(hào)通路。4.TCA對(duì)LX-2細(xì)胞的以上促增殖作用通過(guò)與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)后增強(qiáng)。共培養(yǎng)組LX-2細(xì)胞上清TGFβ1水平較LX-2細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組顯著增加。結(jié)論:TCA可能通過(guò)上調(diào)TLR4/HO-1信號(hào)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞炎癥反應(yīng),并促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖,進(jìn)而加劇肝硬化的進(jìn)展。TCA不僅僅是肝硬化進(jìn)展的活性促進(jìn)因子,TCA可能成為膽汁淤積性肝病預(yù)防和治療的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2
【圖文】：

圖 1 Tanswell 共培養(yǎng)模式圖印跡（Western blot）方法檢測(cè) HepG2 細(xì)胞以及 LX-2 細(xì)胞中目蛋白提取IPA 裂解液，對(duì) HepG2 細(xì)胞以及 LX-2 細(xì)胞進(jìn)行裂解，裂解液融化，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF（為了避免細(xì)胞蛋白降解度為 1mM；板內(nèi)的培養(yǎng)基，預(yù)冷 PBS 洗兩遍。每孔加入 RIPA 裂解液 10吹打數(shù)下，邊吹打邊輕輕晃動(dòng)，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，；充分裂解后，12000g 離心 30min，取上清。部分進(jìn)行 BCA 蛋0℃冰箱凍存。

圖 2 （A）CCK8 毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HepG2 細(xì)胞的存活率（B）CCK8 增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè) LX-2 細(xì)胞的增殖率（*P<0.05）2. TCA 對(duì)肝細(xì)胞 TLR4 以及 HO-1 表達(dá)的影響基于以上的結(jié)果，我們選取 50μM 以及 100μM TCA 作為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)濃度。我們可以從圖 3 看出，相比對(duì)照組，HepG2 細(xì)胞 TLR4 的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。而且，HepG2 細(xì)胞的 HO-1 表達(dá)水平也被 TCA 顯著誘導(dǎo)(P<0.05)。

圖 4 TCA 對(duì) LX-2 細(xì)胞 CoI1A1、α-SMA、HO-1 以及 TLR4 表達(dá)的影響：*P<0.05。4. TCA 加劇了與 HepG2 細(xì)胞共培養(yǎng)的 LX-2 細(xì)胞的增殖通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們得出 TCA 能上調(diào) HepG2 細(xì)胞促炎性基因 TLR4 以及 HO-表達(dá)。而且，TCA 能促進(jìn) LX-2 細(xì)胞的增殖。因此，我們對(duì)這兩種細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)探討兩種細(xì)胞的交互作用。如圖 5 所示，我們的結(jié)果顯示當(dāng) LX-2 細(xì)胞與 HepG細(xì)胞共培養(yǎng)后，TCA 促進(jìn) LX-2 細(xì)胞的增殖效應(yīng)更為顯著。相比 LX-2 細(xì)胞單獨(dú)用50μM TCA 處理組,50μM TCA 共培養(yǎng)組 LX-2 細(xì)胞的 CoI1A1 蛋白表達(dá)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，100μM TCA 單獨(dú)培養(yǎng)組與 100μM TCA 共培養(yǎng)組的 LX-2 細(xì)胞相比，后者的 CoI1A1 蛋白上調(diào)明顯（P<0.05）。我們又檢測(cè)了LX-2 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組與共培養(yǎng)組 LX-2 細(xì)胞的 HO-1、TLR4 的蛋白表達(dá)水平，我們的數(shù)據(jù)顯示共培養(yǎng)組的 LX-2 細(xì)胞的 HO-1 以及 TLR4 的表達(dá)水平被明顯誘導(dǎo)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Qiu-Ming Wang;Jian-Ling Du;Zhi-Jun Duan;Shi-Bin Guo;Xiao-Yu Sun;Zhen Liu;;Inhibiting heme oxygenase-1 attenuates rat liver fibrosis by removing iron accumulation[J];World Journal of Gastroenterology;2013年19期

2 ;Influence of heme oxygenase-1 expression on immune liver fibrosis induced by cobalt protoporphyrin in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2009年24期

3 Matthias Froh;Lars Conzelmann;Peter Walbrun;Susanne Netter;Reiner Wiest;Michael D Wheeler;Mark Lehnert;Takehiko Uesugi;Jurgen Scholmerich;Ronald G Thurman;;Heme oxygenase-1 overexpression increases liver injury after bile duct ligation in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2007年25期

本文編號(hào)：2761586