【摘要】：[背景及目的] 我國是乙肝病毒(HBV)感染高發(fā)地區(qū),2006年我國乙肝流行病學(xué)調(diào)查顯示,目前我國1-59歲乙肝表面抗原(HbsAg)人群攜帶率為7.18%,兒童(5歲以下)HBsAg攜帶率為0.96%,據(jù)此估算,目前我國HBV慢性感染者約9300萬人,其中約2000萬患者為慢性乙肝。慢性乙肝患者中約1%發(fā)展為重型肝炎。由于多種原因所致肝細(xì)胞大量壞死,導(dǎo)致肝臟合成、代謝、生物轉(zhuǎn)化、解毒、排泄等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙,并出現(xiàn)肝性腦病、腦水腫、感染、出血等嚴(yán)重并發(fā)癥的臨床綜合征稱之為重型肝炎或肝功能衰竭,是目前臨床常見的急危重癥。在歐美國家,藥物及酒精是引起重型肝炎的主要原因,在我國,重型肝炎則主要由肝炎病毒,尤其是HBV感染所致(約70%)。重型肝炎來勢兇險(xiǎn)、病情嚴(yán)重、發(fā)展迅速、病死率高,嚴(yán)重威脅患者生命。重型肝炎的發(fā)病機(jī)制尚未明了,目前臨床上仍缺乏有效治療手段,雖然部分患者可通過肝移植手術(shù)挽救生命,但移植后1年生存率也僅為50%-60%,因此絕大部分重型肝炎患者預(yù)后不良,死亡率可達(dá)到70%-80%。開發(fā)與重型肝炎發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因治療的方法正成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向。 原發(fā)性肝癌是惡性程度極高、預(yù)后極差的惡性腫瘤,居惡性腫瘤發(fā)生率的第五位、病死率的第三位。全世界每年約有65萬人死于肝癌。全世界80%以上的肝癌患者集中在亞洲和非洲,其中中國占了約50%。在中國,肝癌多由乙肝所致肝硬化演變而來,而在西方國家,由于HCV感染和非酒精性脂肪肝患者的增加使得肝癌的發(fā)病率逐年增加。傳統(tǒng)的肝癌治療手段包括外科切除、肝移植、放療和化療。然而,無論是手術(shù)切除還是肝移植均存在著術(shù)后的高復(fù)發(fā)率問題,且肝移植供體貧乏,加之肝細(xì)胞癌對化療和放療均不敏感,使得肝癌的臨床診療仍缺乏有效的治療手段。因此,針對肝癌診治新技術(shù)、新療法如基因治療和分子靶向治療的研究則顯得尤為重要和迫切。 在重型肝炎的發(fā)病過程中,涉及到多種炎性分子的異常表達(dá),如Fas/FasL系統(tǒng)、TNFa/TNFR1系統(tǒng)介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡和fgl2介導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死。在重型肝炎時(shí),體內(nèi)殘存的肝細(xì)胞過度表達(dá)Fas,同時(shí)大量激活的CTL異常高表達(dá)FasL,且血清可溶性FasL水平顯著增高,從而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。TNFa由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,它有兩種受體,即TNFR1和TNFR2,有研究表明,TNFa及TNFR1的表達(dá)水平與重型肝炎的病變程度相一致,同時(shí)凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目與TNFa的表達(dá)呈現(xiàn)非常顯著的正相關(guān)。Fgl2凝血酶原酶被稱為“免疫凝血”,它具有免疫調(diào)節(jié)功能和凝血功能。作為新型凝血酶原酶,fgl2可直接促進(jìn)凝血酶的生成而不依賴于其它凝血因子,凝血酶可通過降解纖維蛋白原形成纖維蛋白導(dǎo)致血栓形成和纖維素的沉積。研究揭示在IFN-y等炎性因子的刺激下,fgl2在重型肝炎中高表達(dá),是肝細(xì)胞壞死的重要分子機(jī)制；本研究所前期利用mfgl2反義質(zhì)粒和shRNA干擾質(zhì)粒可顯著減輕暴發(fā)性肝炎小鼠肝組織病理損傷,減少炎性細(xì)胞的浸潤、纖維素的沉積,從而提高暴肝小鼠生存率至33.3%。 Fgl2與肝癌的發(fā)生、發(fā)展也有密切關(guān)系。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)常見實(shí)體腫瘤如肝癌、食管癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的實(shí)質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)浸潤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均有fgl2凝血酶原酶的廣泛表達(dá),并與纖維蛋白沉積有密切組織學(xué)關(guān)系。作為凝血酶的上游基因,我們推測fgl2在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及血管新生中亦發(fā)揮了重要作用。我們應(yīng)用裸鼠角膜血管新生模型和腫瘤皮下瘤移植模型顯示fgl2基因沉寂后的人肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的能力顯著降低；Fgl2敲除的高侵襲性人肝癌細(xì)胞HCCLM6細(xì)胞增殖能力、侵襲能力,耐受TNFa誘導(dǎo)的凋亡能力、表達(dá)促血管生成因子如IL-8、VEGF的能力較未干擾HCCLM6細(xì)胞及非相關(guān)對照HCCLM6細(xì)胞均顯著下降,表明fgl2在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。進(jìn)一步研究表明：分泌型fgl2在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)上調(diào)通過激活p38-MAPK通路和抑制JNK通路實(shí)現(xiàn)。上述變化可增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的致炎活性,抑制向樹突狀細(xì)胞分化,繼而可能抑制腫瘤特異性T細(xì)胞免疫；而膜結(jié)合型fgl2在單核巨噬細(xì)胞的表達(dá)則可能通過活化p38-MAPK和ERK途徑促進(jìn)細(xì)胞的增殖。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA (dsRNA)分子降解相應(yīng)序列的mRNA,導(dǎo)致靶基因表達(dá)沉默的過程,是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默,具有高效、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)。作為一種自然防御機(jī)制,RNA干擾在許多物種如線蟲、果蠅、植物以及哺乳動(dòng)物中都存在,可防止生物體受到病毒或其它外源核酸的入侵,同時(shí)在生物生長發(fā)育中發(fā)揮著基因表達(dá)調(diào)控的作用。目前發(fā)現(xiàn)有兩種非編碼小干擾RNA：小的干涉RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA). RNA干擾現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以后,越來越多的研究者將其廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)的研究。近年來,RNA干擾技術(shù)作為一種治療工具,在預(yù)防和治療人類疾病如感染性疾病、腫瘤、某些代謝性疾病等方面也取得了矚目的成績。 本研究旨在利用miRNA技術(shù)干預(yù)在重型肝炎、肝癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用的致病基因,研究基因治療的可行性,為重型肝炎、肝癌的防治開辟出新方法。具體研究內(nèi)容如下： 1、針對與重型病毒性肝炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子mfgl2,構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的miRNA即Ad-mfgl2-miRNA,探索其對目的基因的沉默效應(yīng)以及聯(lián)合應(yīng)用(Ad-mfgl2-miRNA、Ad-mFas-mTNFR1-miRNA)對暴發(fā)性肝炎小鼠病程的干預(yù)作用； 2、利用Ad-hfgl2-miRNA沉默肝癌中高表達(dá)的fgl2,觀察其對裸鼠人肝癌皮下移植瘤的靶向干預(yù)作用。 [研究方法] 1、通過Gateway技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)生小鼠fg12-miRNA的表達(dá)載體P-mfgl2-miRNA和非相關(guān)對照質(zhì)粒,分別連入5型缺陷型腺病毒載體中,形成Ad-mfgl2-miRNA和Ad-neg-miRNA。細(xì)胞水平共轉(zhuǎn)染Ad-mfgl2-miRNA和pcDNA3.1-mfg12表達(dá)質(zhì)粒,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot觀察fgl2在基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平表達(dá)量的改變。 2、建立MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠暴發(fā)性肝炎模型；通過尾靜脈注射將Ad-mfg12-miRNA和／或Ad-mFas-mTNFR 1-miRNA(實(shí)驗(yàn)室保存)導(dǎo)入小鼠體內(nèi),取小鼠眼球血檢測血清生化學(xué)指標(biāo)的改變、肝組織HE染色檢測小鼠肝組織病理變化,并觀察暴發(fā)性肝炎小鼠生存率的變化；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot及免疫組化檢測各組小鼠肝組織中目的基因的表達(dá)情況；通過TUNNEL法檢測各組小鼠肝組織中肝細(xì)胞凋亡情況。 3、建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型,瘤內(nèi)注射Ad-hfg12-miRNA(實(shí)驗(yàn)室保存),優(yōu)化治療劑量；觀察裸鼠皮下瘤的動(dòng)態(tài)生長變化,計(jì)算相對腫瘤增殖率；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測瘤組織中fgl2的表達(dá),免疫組化檢測瘤組織中fgl2、纖維蛋白以及血管新生標(biāo)志物CD31的表達(dá),并計(jì)算瘤組織中微血管密度。 [結(jié)果] 1、成功構(gòu)建了腺病毒介導(dǎo)的針對小鼠fgl2的miRNA和非相關(guān)對照miRNA,測序鑒定無誤。在CHO細(xì)胞中,干預(yù)組fgl2在RNA水平及蛋白水平的表達(dá)均較非相關(guān)對照組和陽性對照組顯著降低。 2、尾靜脈注射Ad-mfg12-miRNA或Ad-mFas-mTNFR 1-miRNA后,可使暴發(fā)性肝炎小鼠生存率從0分別提高到38.9%和16.7%,而上述兩種腺病毒聯(lián)合干預(yù)后的暴肝小鼠生存率可提高到44.4%。干預(yù)組小鼠均可見肝組織病理學(xué)變化和血清學(xué)指標(biāo)的明顯改善；小鼠肝組織中相應(yīng)靶基因的表達(dá)和肝細(xì)胞凋亡在干預(yù)組受到明顯抑制。 3、經(jīng)Ad-hfg12-miRNA處理后,干預(yù)組小鼠的整體狀態(tài)好于非相關(guān)對照組和空白對照組小鼠,瘤塊明顯小于后兩組小鼠的瘤塊。與非相關(guān)對照及空白對照相比,其相對腫瘤增殖率分別達(dá)到29.9%和36.7%,同時(shí),也檢測到了注射腺病毒注射液后,受體組織腫瘤細(xì)胞中hfg12 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均出現(xiàn)了抑制,證實(shí)了Ad-hfg12-miRNA對hfg12凝血酶原酶基因的沉默作用,此外,瘤組織中纖維蛋白沉積及新生血管也較對照組明顯降低。 [結(jié)論] 1、本研究成功構(gòu)建了Ad-mfg12-miRNA,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均觀察到其高效特異的下調(diào)目的基因表達(dá)的作用。 2、本研究表明fgl2、Fas及TNFR1可作為重型肝炎基因治療的靶點(diǎn),基于重型肝炎相關(guān)基因的體內(nèi)聯(lián)合干預(yù)較單獨(dú)干預(yù)顯示出了更為顯著的治療效果,利用miRNA沉默fgl2、Fas及TNFR1基因?yàn)橹匦透窝椎闹委熖峁┝诵碌牟呗浴?3、本研究顯示Ad-hfg12-miRNA可顯著抑制裸鼠人肝癌皮下移植瘤生長,干預(yù)效果明顯,為今后肝癌等惡性腫瘤的治療提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575.1;R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2760607