【摘要】：研究背景 眾所周知,各種慢性肝病可由肝纖維化發(fā)展為肝硬化,門靜脈高壓是肝硬化的嚴(yán)重并發(fā)癥。肝硬化狀態(tài)下,肝內(nèi)血管阻力的增加是導(dǎo)致門靜脈高壓的重要因素。肝呈狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纖維化細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞,HSC活化在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展以及門脈高壓形成一系列過(guò)程中起關(guān)鍵作用�；罨腍SC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,不斷增殖,并獲得收縮性。當(dāng)HSC發(fā)生強(qiáng)烈收縮,致使肝竇直徑縮小,肝內(nèi)血管阻力增大;同時(shí)可引起肝組織瘢痕攣縮,進(jìn)一步增加肝內(nèi)血管阻力,導(dǎo)致門靜脈高壓�？梢�,HSC收縮的調(diào)控機(jī)制是門靜脈高壓機(jī)理研究的重要一環(huán)。近年來(lái),肝內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)已成為肝纖維化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是RAAS的重要效應(yīng)分子,可誘導(dǎo)HSC的活化和增殖而促進(jìn)肝纖維化的形成,肝內(nèi)ACE-AngⅡ-AT1R軸與門靜脈高壓的形成有密切的關(guān)系。研究還表明合成醛固酮(AIdosterone,AIdo)也具有和AngⅡ似的作用。然而目前有關(guān)AngⅡ和AIdo誘導(dǎo)HSC收縮的機(jī)制的研究較為鮮見,其作用機(jī)制尚不明確。HSC活化后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,具有平滑肌細(xì)胞的特征,提示HSC收縮和平滑肌細(xì)胞收縮的分子機(jī)制是類似的,可通過(guò)鈣離子依賴性和非鈣離子依賴性兩種通路完成收縮。在非鈣途徑中,RhoA-Rock通路對(duì)HSC收縮的調(diào)控機(jī)制是近年研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)觀察AngⅡ和AIdo對(duì)HSC收縮及RhoA-Rock信號(hào)通路上各元件表達(dá)的影響來(lái)闡明其對(duì)HSC收縮機(jī)制的影響。 目的 探討血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)和醛固酮(Aldosterone,Aldo)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)收縮以及由Rho激酶介導(dǎo)的非Ca~(2+)依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。 方法 采用HSC-T6細(xì)胞株,給予AngⅡ和Aldo 1μmol/L處理,聚硅酮膜法直觀檢測(cè)HSC的收縮性;激光共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察HSC胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化;另予AngⅡ和Aldo 10μmol/L處理,免疫印跡法檢測(cè)肌球蛋白輕鏈(myosin lightchain.MLC)和磷酸化MLC表達(dá)水平。觀察AngⅡ1型受體(AT-1受體)阻斷劑伊貝沙坦(irbesartan)、Aldo受體阻斷劑安體舒通(antisterone)、PKC(Protein kinaseC)特異性抑制劑Stauro、Rho激酶特異性抑制劑Y27632、MLCK(myosin lightchain kinase,MLCK)特異性抑制劑ML-7對(duì)磷酸化MLC表達(dá)水平的影響;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Rho-Rock通路中Rock_2(Rho kinase_2)、RhoAGTP、RhoGEF(Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors,RhoGEF)及PKCmRNA的表達(dá)。 結(jié)果 AngⅡ和Aldo均可誘導(dǎo)HSC的收縮;AngⅡ可促進(jìn)HSC胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加,而Aldo對(duì)HSC胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化無(wú)顯著性影響。AngⅡ和Aldo均可誘導(dǎo)磷酸化MLC蛋白水平的變化,并呈時(shí)間依賴性,均在刺激15min達(dá)到峰值后逐漸減低。AngⅡ+Irbesartan和AngⅡ+Y27632處理組可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的MLC蛋白磷酸化水。而AngⅡ+ML-7+Stauro聯(lián)合處理組磷酸化MLC蛋白水平顯著高于AngⅡ+Y27632處理組(P=0.003)。AngⅡ+Y27632+ML-7+Stauro四者聯(lián)合作用可使磷酸化MLC蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。Aldo處理組磷酸化MLC蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P=0.001);安體舒通和Y27632可抑制Aldo誘導(dǎo)的MLC蛋白磷酸化水平;Aldo+ML-7+Staur聯(lián)合處理組磷酸化MLC蛋白水平顯著低于Aldo+Y27632處理組(P=0.022)。Aldo+Y27632+ML-7+Stauro三者聯(lián)合作用可使磷酸化MLC蛋白水平顯著降低,與Aldo處理組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。AngⅡ處理組Rock2、RhoAGTP、RhoGEF mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng),AngⅡ+Irbesartan處理組三種元件的表達(dá)顯著減弱。AngⅡ+Y27632處理組Rock2與RhoGEF mRNA的表達(dá)減弱,RhoAGTP的表達(dá)增強(qiáng)。ML-7和Stauro聯(lián)合抑制組以及Y27632、ML-7和Stauro三種阻斷劑聯(lián)合抑制組,三種元件的表達(dá)均增強(qiáng)。Aldo組Rock_2、RhoAGTP、RhoGEF和PKC mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng),而其阻斷劑安體舒通可明顯抑制這四種元件mRNA的表達(dá)。Aldo+Y27632組上述四種元件mRNA的表達(dá)較Aldo組減弱。Aldo+ML-7+Stauro聯(lián)合組斷后四種元件的mRNA表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng),Y27632、ML-7和Stauro三者同時(shí)抑制組,RhoGEF的表達(dá)較ML-7+Stauro聯(lián)合抑制組增強(qiáng),PKC mRNA的表達(dá)減弱。 結(jié)論 AngⅡ和Aldo均可誘導(dǎo)HSC的收縮;AngⅡ可促進(jìn)HSC胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加,Aldo對(duì)HSC胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化無(wú)顯著性影響。AngⅡ主要通過(guò)RhoA-Rock信號(hào)通路誘導(dǎo)HSC的收縮;Aldo可通過(guò)RhoA-Rock信號(hào)通路誘導(dǎo)HSC的收縮。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R575.2
【圖文】：

聚硅酮膜觀測(cè)HSC收縮原理示意圖

正常HSGTG(x200)

陰性對(duì)照組(

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