【摘要】： 胃癌仍然是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一。最新報(bào)道指出每年新增胃癌病例870，000例，而死亡病例650，000例，占據(jù)腫瘤死因的第二位。由于缺乏有效的早期診斷方法，進(jìn)展期胃癌病人的5年存活率僅有20％左右。國內(nèi)外均有學(xué)者提出，能否在胃癌前疾病階段就予以干預(yù)逆轉(zhuǎn)治療，即Ⅰ級預(yù)防胃癌的發(fā)生。因此深入了解胃癌前病變，有可能為胃癌的Ⅰ級預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。 慢性萎縮性胃炎是我國常見的慢性胃黏膜病變，其組織學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為胃黏膜的慢性炎癥和胃腺體細(xì)胞的丟失，并伴隨腸上皮化生或纖維組織增生。目前普遍認(rèn)為萎縮性胃炎與腸型胃癌關(guān)系密切，癌變概率可達(dá)1-7.46％，WHO已將其定義為胃癌前疾病。 幽門螺桿菌作為Ⅰ類致癌源，是目前最為明確的萎縮性胃炎致病因子，它可以通過誘導(dǎo)萎縮性胃炎而促進(jìn)胃癌的發(fā)生。幽門螺桿菌導(dǎo)致的萎縮性胃炎的發(fā)生除了與感染菌株和感染對象所處的外界因素有關(guān)，還主要與宿主的內(nèi)在因素如基因易感性、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)等有關(guān)。 目前國內(nèi)外有關(guān)萎縮性胃炎的發(fā)病機(jī)制研究很少，深入探討萎縮性胃炎分子機(jī)制，考慮如何調(diào)動機(jī)體細(xì)胞自身的適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制以減少細(xì)胞損傷，正逐漸成為萎縮性胃炎等癌前疾病防治的重要課題。 熱休克蛋白70(Heat shock protein 70，HSP70)是生物進(jìn)化過程中高度保守的應(yīng)激反應(yīng)蛋白，當(dāng)組織或細(xì)胞遭受各種刺激損害時(shí)，HSP70作為細(xì)胞內(nèi)分子伴侶，能結(jié)合新生或未折疊蛋白，穩(wěn)定或輔助其正確的空間構(gòu)象；能結(jié)合變性蛋白，促進(jìn)其降解；還能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫系統(tǒng)，維持細(xì)胞的完整性。此外，HSP70還是重要的增殖與凋亡平衡的調(diào)節(jié)蛋白。近年來，在一些胃黏膜病變(如胃潰瘍、門脈高壓性胃病、慢性胃炎等)的損傷修復(fù)研究中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)HSP70表達(dá)能增強(qiáng)胃黏膜細(xì)胞對各種損傷刺激的抵抗力，并促進(jìn)細(xì)胞的增殖修復(fù)，提示HSP70對胃黏膜細(xì)胞具有保護(hù)作用。 萎縮性胃炎是各種損傷刺激長期作用于胃黏膜所致結(jié)果，但目前對于應(yīng)激反應(yīng)蛋白HSP70在萎縮性胃炎中的表達(dá)變化及其對胃黏膜細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚不明確。本課題擬通過對萎縮性胃炎患者胃黏膜的檢測，了解HSP70表達(dá)狀態(tài)，并采用現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)，通過建立實(shí)驗(yàn)性大鼠萎縮性胃炎模型及體外幽門螺桿菌感染胃黏膜上皮細(xì)胞模型等途徑來研究HSP70對萎縮性胃炎的作用、影響及機(jī)制，為萎縮性胃炎的防治提供科學(xué)依據(jù)和尋求可行的靶向目標(biāo)。 一．材料和方法： 1．收集萎縮性胃炎病人的胃鏡活檢標(biāo)本，分別以免疫組化、Westsrn blot來定性定量檢測HSP70表達(dá)情況，單因素及多因線性回歸分析萎縮性胃炎與HSP70的相關(guān)性。 2．按“姒氏造模法”建立大鼠慢性萎縮性胃炎模型。成模后，參照1994年美國休斯頓胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，分別觀察各組大鼠胃竇黏膜病理變化，定量分析胃竇腺體層厚度，單位長度內(nèi)的腺體個(gè)數(shù)、炎癥指數(shù)等指標(biāo)，以免疫組化和Western blot評價(jià)HSP70表達(dá)，并分別給予HSP70誘導(dǎo)劑戊四烯酮(geranylgeranylacetone，GGA)、HSP70抑制劑櫟精及相應(yīng)溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)灌胃處理4周。以證實(shí)HSP70水平與萎縮性胃炎形成的相關(guān)性。 3．用不同濃度櫟精抑制胃黏膜細(xì)胞AGS的HSP70表達(dá)，觀察細(xì)胞活力和細(xì)胞周期變化，檢測細(xì)胞凋亡和Bax、Bcl-2、AIF、clcaved caspase-3等凋亡蛋白表達(dá)的情況。以HSP70siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染AGs細(xì)胞，并利用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，通過小RNA干擾技術(shù)，觀察HSP70對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用。 4．將幽門螺桿菌(ATCC700392)與HSP70siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株或空載體對照細(xì)胞株共培養(yǎng)，觀察HSP70表達(dá)抑制的胃黏膜細(xì)胞在模擬幽門螺桿菌感染狀態(tài)下的細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖周期改變，并檢測Bax、Cyto c、caspase-3、caspase-6、caspase-7和AIF的表達(dá)情況；并將外源重組HSP70蛋白(50ng／ml)加入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞與幽門螺桿菌的共培養(yǎng)液中，對比檢測Bax、細(xì)胞色素c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7和AIF等凋亡蛋白的表達(dá)變化。 二、主要結(jié)果： 1．萎縮性胃炎病人胃黏膜HSP70表達(dá)較正常對照組減少，尤以輕、中度萎縮黏膜HSP70表達(dá)減少更為明顯。 2．成功建立大鼠萎縮性胃炎模型，可見局部淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，胃竇腺體排列紊亂、稀疏，腺體層變薄，HSP70表達(dá)較正常對照減少；GGA誘導(dǎo)胃黏膜組織HSP70表達(dá)增強(qiáng)，并對大鼠萎縮性胃炎有保護(hù)和治療作用，表現(xiàn)為萎縮性胃炎的胃黏膜炎癥情況明顯好轉(zhuǎn)，腺體層增厚，腺體排列較整齊緊密；而櫟精抑制胃黏膜細(xì)胞HSP70表達(dá)同時(shí)進(jìn)一步加重炎癥細(xì)胞浸潤，胃黏膜充血水腫明顯，腺體層薄而稀疏、排列紊亂。 3．櫟精抑制體外胃黏膜細(xì)胞模型AGS的HSP70表達(dá)，抑制作用呈劑量依賴性；伴隨著HSP70表達(dá)的逐漸減少，胃黏膜細(xì)胞活力也逐漸受抑，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期阻滯和細(xì)胞凋亡增加；凋亡相關(guān)蛋白Bax，cleaved caspase-3和AIF表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)減少。 4．HSP70siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后，HSP70表達(dá)較對照細(xì)胞明顯下調(diào)；細(xì)胞生長延緩，S期細(xì)胞所占比例增加，凋亡相關(guān)蛋白Bax、AIF和胞漿Cyto c表達(dá)上調(diào)。 5．幽門螺桿菌與胃黏膜細(xì)胞共培養(yǎng)呈現(xiàn)早期促增殖和后期抑制的明顯作用；但下調(diào)HSP70表達(dá)使幽門螺桿菌對胃黏膜細(xì)胞生長活力抑制作用更加顯著；HSP70siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞在幽門螺桿菌作用下，與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，S期細(xì)胞積聚增加，凋亡較明顯，并伴隨線粒體內(nèi)Cyto c含量減少，胞漿內(nèi)Cyto c增加，AIF表達(dá)上調(diào)，Caspase-3前體蛋白表達(dá)減少；加入外源重組HSP70后線粒體Cytoc的釋放顯著減少，并進(jìn)一步誘導(dǎo)AIF蛋白表達(dá)。 三、結(jié)論 1．臨床和實(shí)驗(yàn)動物證實(shí)萎縮性胃炎HSP70表達(dá)減少；HSP70誘導(dǎo)劑-GGA能促進(jìn)大鼠萎縮性胃炎胃黏膜細(xì)胞的修復(fù)，減輕炎癥細(xì)胞的浸潤；而HSP70抑制劑-櫟精則加重了黏膜炎癥情況，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈提示HSP70與萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 2櫟精抑制體外胃黏膜細(xì)胞模型AGS的HSP70表達(dá)并顯著抑制細(xì)胞活力，表現(xiàn)為細(xì)胞周期的S期阻滯和細(xì)胞凋亡增加，線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bax、AIF、cleaved caspase-3和Bcl-2的表達(dá)變化進(jìn)一步提示HSP70減少將促進(jìn)萎縮性胃炎的發(fā)展。參與機(jī)制可能與HSP70調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞增殖及凋亡作用有關(guān)。 3．成功建立和篩選體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的胃黏膜AGS細(xì)胞株，可見該細(xì)胞HSP70表達(dá)明顯減少，細(xì)胞生長延緩，細(xì)胞周期呈S期阻滯，細(xì)胞凋亡蛋白Bax、AIF和胞漿Cyto c增加，提示HSP70siRNA轉(zhuǎn)染會顯著削弱細(xì)胞自穩(wěn)調(diào)節(jié)能力，內(nèi)源HSP70對維持細(xì)胞正常的生長和凋亡有重要作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡平衡發(fā)揮其在損傷中的保護(hù)作用。。 4．幽門螺桿菌對胃黏膜AGS細(xì)胞有明顯的早期促增殖和后期抑制作用；這種作用不依賴于HSP70表達(dá)的高低，但抑制AGS細(xì)胞HSP70表達(dá)會進(jìn)一步促進(jìn)幽門螺桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生，表明幽門螺桿菌與HSP在萎縮性胃炎發(fā)病中可能是二個(gè)獨(dú)立的相關(guān)因素。HSP70可以通過對細(xì)胞周期及線粒體凋亡通路蛋白的調(diào)節(jié)拮抗H．pylori誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制作用。 5．尋求可靠、安全的提高內(nèi)源性HSP70保護(hù)水平的方法，結(jié)合根除幽門螺桿菌等抗損傷療法可能是治療萎縮性胃炎減少胃癌發(fā)生的有效途徑。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R573.3
【圖文】：

HSP70在所有標(biāo)本中均有陽性表達(dá).陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕褐色陽性顆粒彌散分布于細(xì)胞漿和部分細(xì)胞核中，主要分布在固有層內(nèi)腺體細(xì)胞和部分的腺上皮細(xì)胞及少量的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)(圖1.1)。圖1.1胃私膜標(biāo)本HSP7O分布:a.姜縮性胃炎;b.正常對照(marker:Ilnm)25

三.胃私膜組織HSP70的表達(dá)變化 we5ternbl。t單因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萎縮性胃炎病人胃私膜HSP70表達(dá)較正常對照減少(只0.05， Wi1ooxon檢驗(yàn))(圖1.2);將萎縮性胃炎病人按不同萎縮程度分組，可見輕、中度姜縮的胃私膜HSP70表達(dá)有逐漸降低趨勢;中度姜縮時(shí)HSP70表達(dá)最低，與對照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(只0.05， WiIcoxon檢驗(yàn))，而重度姜縮時(shí)HSP70表達(dá)增加，但與各組比較未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1.3)。將萎縮性胃炎病人按不同腸化程度進(jìn)行分組后發(fā)現(xiàn)，與正常對照比較，各腸化組胃私膜HSP70表達(dá)均有減少，其中輕度腸化組HSP70減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(只0.05

將萎縮性胃炎病人按不同腸化程度進(jìn)行分組后發(fā)現(xiàn)，與正常對照比較，各腸化組胃私膜HSP70表達(dá)均有減少，其中輕度腸化組HSP70減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(只0.05，wil。oxon檢驗(yàn));而腸化各組之間比較沒有顯著性差異(圖1.4)。H.pyl。ri感染一定程度上抑制了HSP70表達(dá)，但未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。曰S戶70aCtinO卜幾仍工

本文編號：2756663