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熱休克蛋白HSP70在萎縮性胃炎的表達及其作用機制研究

發(fā)布時間:2020-07-15 15:20
【摘要】: 胃癌仍然是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一。最新報道指出每年新增胃癌病例870,000例,而死亡病例650,000例,占據(jù)腫瘤死因的第二位。由于缺乏有效的早期診斷方法,進展期胃癌病人的5年存活率僅有20%左右。國內(nèi)外均有學者提出,能否在胃癌前疾病階段就予以干預逆轉(zhuǎn)治療,即Ⅰ級預防胃癌的發(fā)生。因此深入了解胃癌前病變,有可能為胃癌的Ⅰ級預防提供科學依據(jù)。 慢性萎縮性胃炎是我國常見的慢性胃黏膜病變,其組織學特點表現(xiàn)為胃黏膜的慢性炎癥和胃腺體細胞的丟失,并伴隨腸上皮化生或纖維組織增生。目前普遍認為萎縮性胃炎與腸型胃癌關系密切,癌變概率可達1-7.46%,WHO已將其定義為胃癌前疾病。 幽門螺桿菌作為Ⅰ類致癌源,是目前最為明確的萎縮性胃炎致病因子,它可以通過誘導萎縮性胃炎而促進胃癌的發(fā)生。幽門螺桿菌導致的萎縮性胃炎的發(fā)生除了與感染菌株和感染對象所處的外界因素有關,還主要與宿主的內(nèi)在因素如基因易感性、細胞應激反應狀態(tài)等有關。 目前國內(nèi)外有關萎縮性胃炎的發(fā)病機制研究很少,深入探討萎縮性胃炎分子機制,考慮如何調(diào)動機體細胞自身的適應性保護機制以減少細胞損傷,正逐漸成為萎縮性胃炎等癌前疾病防治的重要課題。 熱休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)是生物進化過程中高度保守的應激反應蛋白,當組織或細胞遭受各種刺激損害時,HSP70作為細胞內(nèi)分子伴侶,能結(jié)合新生或未折疊蛋白,穩(wěn)定或輔助其正確的空間構象;能結(jié)合變性蛋白,促進其降解;還能調(diào)節(jié)細胞免疫系統(tǒng),維持細胞的完整性。此外,HSP70還是重要的增殖與凋亡平衡的調(diào)節(jié)蛋白。近年來,在一些胃黏膜病變(如胃潰瘍、門脈高壓性胃病、慢性胃炎等)的損傷修復研究中發(fā)現(xiàn),誘導HSP70表達能增強胃黏膜細胞對各種損傷刺激的抵抗力,并促進細胞的增殖修復,提示HSP70對胃黏膜細胞具有保護作用。 萎縮性胃炎是各種損傷刺激長期作用于胃黏膜所致結(jié)果,但目前對于應激反應蛋白HSP70在萎縮性胃炎中的表達變化及其對胃黏膜細胞的具體作用機制尚不明確。本課題擬通過對萎縮性胃炎患者胃黏膜的檢測,了解HSP70表達狀態(tài),并采用現(xiàn)代細胞與分子生物學技術,通過建立實驗性大鼠萎縮性胃炎模型及體外幽門螺桿菌感染胃黏膜上皮細胞模型等途徑來研究HSP70對萎縮性胃炎的作用、影響及機制,為萎縮性胃炎的防治提供科學依據(jù)和尋求可行的靶向目標。 一.材料和方法: 1.收集萎縮性胃炎病人的胃鏡活檢標本,分別以免疫組化、Westsrn blot來定性定量檢測HSP70表達情況,單因素及多因線性回歸分析萎縮性胃炎與HSP70的相關性。 2.按“姒氏造模法”建立大鼠慢性萎縮性胃炎模型。成模后,參照1994年美國休斯頓胃炎診斷標準,分別觀察各組大鼠胃竇黏膜病理變化,定量分析胃竇腺體層厚度,單位長度內(nèi)的腺體個數(shù)、炎癥指數(shù)等指標,以免疫組化和Western blot評價HSP70表達,并分別給予HSP70誘導劑戊四烯酮(geranylgeranylacetone,GGA)、HSP70抑制劑櫟精及相應溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)灌胃處理4周。以證實HSP70水平與萎縮性胃炎形成的相關性。 3.用不同濃度櫟精抑制胃黏膜細胞AGS的HSP70表達,觀察細胞活力和細胞周期變化,檢測細胞凋亡和Bax、Bcl-2、AIF、clcaved caspase-3等凋亡蛋白表達的情況。以HSP70siRNA表達載體轉(zhuǎn)染AGs細胞,并利用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,通過小RNA干擾技術,觀察HSP70對細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用。 4.將幽門螺桿菌(ATCC700392)與HSP70siRNA轉(zhuǎn)染細胞株或空載體對照細胞株共培養(yǎng),觀察HSP70表達抑制的胃黏膜細胞在模擬幽門螺桿菌感染狀態(tài)下的細胞活力和細胞增殖周期改變,并檢測Bax、Cyto c、caspase-3、caspase-6、caspase-7和AIF的表達情況;并將外源重組HSP70蛋白(50ng/ml)加入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞與幽門螺桿菌的共培養(yǎng)液中,對比檢測Bax、細胞色素c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7和AIF等凋亡蛋白的表達變化。 二、主要結(jié)果: 1.萎縮性胃炎病人胃黏膜HSP70表達較正常對照組減少,尤以輕、中度萎縮黏膜HSP70表達減少更為明顯。 2.成功建立大鼠萎縮性胃炎模型,可見局部淋巴細胞和漿細胞浸潤,胃竇腺體排列紊亂、稀疏,腺體層變薄,HSP70表達較正常對照減少;GGA誘導胃黏膜組織HSP70表達增強,并對大鼠萎縮性胃炎有保護和治療作用,表現(xiàn)為萎縮性胃炎的胃黏膜炎癥情況明顯好轉(zhuǎn),腺體層增厚,腺體排列較整齊緊密;而櫟精抑制胃黏膜細胞HSP70表達同時進一步加重炎癥細胞浸潤,胃黏膜充血水腫明顯,腺體層薄而稀疏、排列紊亂。 3.櫟精抑制體外胃黏膜細胞模型AGS的HSP70表達,抑制作用呈劑量依賴性;伴隨著HSP70表達的逐漸減少,胃黏膜細胞活力也逐漸受抑,并誘導細胞周期S期阻滯和細胞凋亡增加;凋亡相關蛋白Bax,cleaved caspase-3和AIF表達上調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達減少。 4.HSP70siRNA質(zhì)粒表達載體體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AGS細胞后,HSP70表達較對照細胞明顯下調(diào);細胞生長延緩,S期細胞所占比例增加,凋亡相關蛋白Bax、AIF和胞漿Cyto c表達上調(diào)。 5.幽門螺桿菌與胃黏膜細胞共培養(yǎng)呈現(xiàn)早期促增殖和后期抑制的明顯作用;但下調(diào)HSP70表達使幽門螺桿菌對胃黏膜細胞生長活力抑制作用更加顯著;HSP70siRNA轉(zhuǎn)染細胞在幽門螺桿菌作用下,與空載體轉(zhuǎn)染細胞比較,S期細胞積聚增加,凋亡較明顯,并伴隨線粒體內(nèi)Cyto c含量減少,胞漿內(nèi)Cyto c增加,AIF表達上調(diào),Caspase-3前體蛋白表達減少;加入外源重組HSP70后線粒體Cytoc的釋放顯著減少,并進一步誘導AIF蛋白表達。 三、結(jié)論 1.臨床和實驗動物證實萎縮性胃炎HSP70表達減少;HSP70誘導劑-GGA能促進大鼠萎縮性胃炎胃黏膜細胞的修復,減輕炎癥細胞的浸潤;而HSP70抑制劑-櫟精則加重了黏膜炎癥情況,這些發(fā)現(xiàn)強烈提示HSP70與萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展有關。 2櫟精抑制體外胃黏膜細胞模型AGS的HSP70表達并顯著抑制細胞活力,表現(xiàn)為細胞周期的S期阻滯和細胞凋亡增加,線粒體凋亡通路相關蛋白Bax、AIF、cleaved caspase-3和Bcl-2的表達變化進一步提示HSP70減少將促進萎縮性胃炎的發(fā)展。參與機制可能與HSP70調(diào)節(jié)胃黏膜細胞增殖及凋亡作用有關。 3.成功建立和篩選體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的胃黏膜AGS細胞株,可見該細胞HSP70表達明顯減少,細胞生長延緩,細胞周期呈S期阻滯,細胞凋亡蛋白Bax、AIF和胞漿Cyto c增加,提示HSP70siRNA轉(zhuǎn)染會顯著削弱細胞自穩(wěn)調(diào)節(jié)能力,內(nèi)源HSP70對維持細胞正常的生長和凋亡有重要作用,通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡平衡發(fā)揮其在損傷中的保護作用。。 4.幽門螺桿菌對胃黏膜AGS細胞有明顯的早期促增殖和后期抑制作用;這種作用不依賴于HSP70表達的高低,但抑制AGS細胞HSP70表達會進一步促進幽門螺桿菌誘導的細胞凋亡發(fā)生,表明幽門螺桿菌與HSP在萎縮性胃炎發(fā)病中可能是二個獨立的相關因素。HSP70可以通過對細胞周期及線粒體凋亡通路蛋白的調(diào)節(jié)拮抗H.pylori誘導的細胞生長抑制作用。 5.尋求可靠、安全的提高內(nèi)源性HSP70保護水平的方法,結(jié)合根除幽門螺桿菌等抗損傷療法可能是治療萎縮性胃炎減少胃癌發(fā)生的有效途徑。
【學位授予單位】:浙江大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2007
【分類號】:R573.3
【圖文】:

胃炎,標本,顆粒彌散


HSP70在所有標本中均有陽性表達.陽性細胞表現(xiàn)為棕褐色陽性顆粒彌散分布于細胞漿和部分細胞核中,主要分布在固有層內(nèi)腺體細胞和部分的腺上皮細胞及少量的間質(zhì)細胞內(nèi)(圖1.1)。圖1.1胃私膜標本HSP7O分布:a.姜縮性胃炎;b.正常對照(marker:Ilnm)25

胃炎,病人,腸化,萎縮性胃炎


三.胃私膜組織HSP70的表達變化 we5ternbl。t單因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),萎縮性胃炎病人胃私膜HSP70表達較正常對照減少(只0.05, Wi1ooxon檢驗)(圖1.2);將萎縮性胃炎病人按不同萎縮程度分組,可見輕、中度姜縮的胃私膜HSP70表達有逐漸降低趨勢;中度姜縮時HSP70表達最低,與對照組比較有顯著統(tǒng)計學差異(只0.05, WiIcoxon檢驗),而重度姜縮時HSP70表達增加,但與各組比較未見明顯統(tǒng)計學差異(圖1.3)。將萎縮性胃炎病人按不同腸化程度進行分組后發(fā)現(xiàn),與正常對照比較,各腸化組胃私膜HSP70表達均有減少,其中輕度腸化組HSP70減少有統(tǒng)計學意義(只0.05

腸化,病人,胃炎


將萎縮性胃炎病人按不同腸化程度進行分組后發(fā)現(xiàn),與正常對照比較,各腸化組胃私膜HSP70表達均有減少,其中輕度腸化組HSP70減少有統(tǒng)計學意義(只0.05,wil。oxon檢驗);而腸化各組之間比較沒有顯著性差異(圖1.4)。H.pyl。ri感染一定程度上抑制了HSP70表達,但未見顯著統(tǒng)計學差異。曰S戶70aCtinO卜幾仍工

本文編號:2756663

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