【摘要】： 目的：高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠構(gòu)建非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)模型,動態(tài)觀察NAFLD大鼠血清學(xué)和肝勻漿指標、IR及肝組織病理改變等指標的變化。 方法：雄性SD大鼠192只,隨機分為對照組(NG)和高脂組(HG)各96只,對照組喂飼普通飼料,高脂組喂飼高脂飼料。于第1周(w)開始、第2、4、8、12、16w末隨機從各組抽取16只大鼠,其中8只行正糖高胰島素鉗夾實驗技術(shù)檢測葡萄糖輸注率(GIR),另8只測量體重、肝指數(shù),門靜脈采血予以生物化學(xué)法檢測空腹血糖(FBS)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)；放射免疫法檢測空腹胰島素(FIns)、腫瘤壞死因子a (TNF-a);分光光度計檢測游離脂肪酸(FFAs);制備肝勻漿分光光度計測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)；大鼠肝組織行HE染色和蘇丹Ⅳ染色,光鏡下對肝臟脂肪變性情況進行評定。 結(jié)果：與同期NG比較：HG大鼠體重、肝指數(shù)、血清ALT、AST、TG、TC、FIns、FFAs、TNF-a及肝勻漿MDA在第8、12、16w末均明顯升高,肝勻漿SOD水平則降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)HG各組間兩兩比較：在第8、12、16w末隨著高脂飼料喂養(yǎng)時間的延長,除肝勻漿SOD水平逐漸降低外,肝指數(shù)、血清各項指標及肝勻漿MDA水平均逐漸升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。與同期NG比較,在第4、8、12、16w末,HG大鼠的GIR水平降低；HG各組間兩兩比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。肝組織病理學(xué)檢查顯示HG大鼠第8w末形成單純性脂肪肝,隨著喂養(yǎng)時間的延長,HG大鼠肝細胞脂肪變性逐漸加重,第12w末形成了非酒精性脂肪性肝炎(non alcoholic steatohepatitis, NASH)。 結(jié)論：高脂飲食喂飼SD大鼠8w成功構(gòu)建單純性脂肪肝模型,12w可形成NASH模型；肝臟脂肪沉積,TNF-α、FFAs.氧化應(yīng)激反應(yīng)都參與了NAFLD的發(fā)生發(fā)展；IR出現(xiàn)在肝臟脂肪變性之前,IR可能是NAFLD發(fā)病的始動因素。 第二部分動態(tài)研究非酒精性脂肪肝病中JNK1蛋白表達及其對胰島素信號通路的影響 目的：動態(tài)觀察非酒精性脂肪肝病(non alcoholic fatty liver disease, NAFLD)中c-jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase-1,JNK1)蛋白表達及其對胰島素(Insulin, INS)信號通路的影響,探討JNK1、INS信號通路蛋白變化及其與IR和NAFLD的關(guān)系。 方法：雄性SD大鼠192只,隨機分為對照組(NG)和高脂組(HG)每組各96只,對照組喂飼普通飼料,高脂組喂飼高脂飼料。于第1周(w)開始、第2、4、8、12、16w末隨機從各組抽取8只大鼠,處死后取肝組織行Western blot檢測JNKl、胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、胰島素受體底物1絲氨酸307磷酸化(phospho-IRS-1 Ser307,p-IRS-1Ser307)、蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)、蛋白激酶B絲氨酸473磷酸化(phospho-PKBSer473,p-PKBSer473)水平。 結(jié)果：第2、4、8、12、16w末,HG與同期NG比較：肝組織JNK1蛋白表達、p-IRS1Ser307水平增高,p-PKBSer473水平降低；HG各組間上述各項指標比較,從第2w末開始,隨著時間的延長,除p-PKBSer473水平逐漸降低外,JNK1蛋白表達及p-IRS1Ser307水平均逐漸升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。NG各組間比較JNK1蛋白表達、p-IRS1Ser307和p-PKBSer473水平,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。各組間兩兩比較IRS-1和PKB蛋白表達,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。JNK1的蛋白表達強度與IR呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.931,p值0.01)。 結(jié)論：高脂飲食可誘導(dǎo)肝組織JNK1蛋白表達增高,增加的JNK1結(jié)合IRS-1后可以上調(diào)p-IRS-1Ser307水平,下調(diào)p-PKBSer473水平,從而干擾INS信號傳導(dǎo),導(dǎo)致IR,引起NAFLD; TNF-α、FFAs、氧化應(yīng)激反應(yīng)通過促進JNK1活性增強,進一步加重IR從而參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程；肝組織的R出現(xiàn)在全身IR和肝臟脂肪變性之前,IR可能是NAFLD發(fā)病的啟動因素。 第三部分應(yīng)用表達DN-JNK1的重組腺病毒治療SD大鼠非酒精性脂肪肝病及其機制研究 目的：應(yīng)用表達失活型c-jun氨基末端激酶1的重組腺病毒(recombinant adenovirus expressing adenovirus expressing dominant negative type c-Jun N-terminal kinase1, Ad-DN-JNK1)治療SD大鼠非酒精性脂肪肝病(non alcoholic fatty liver disease, NAFLD),探討其對NAFLD的治療作用及作用機制。 方法：雄性SD大鼠96只,隨機分為對照組(NG)32只、高脂組(HG)64只,對照組喂飼普通飼料,高脂組喂飼高脂飼料。于第8周(w)末隨機從各組抽取16只大鼠,其中8只行正糖高胰島素鉗夾實驗技術(shù)(鉗夾技術(shù))檢測葡萄糖輸注率(GIR),另8只門靜脈抽血和肝組織病理切片鑒定成模后,將余下的16只對照組大鼠繼續(xù)喂飼普通飼料至12w末稱為12w對照組(NG12w)；余下的高脂組大鼠隨機分為12w高脂組(HG12w),攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)組和Ad-DN-JNK1組,各組均16只,此3組均喂飼高脂飼料至12w末。第8w末,NG12w和HG12w大鼠均從尾靜脈注入1ml生理鹽水作為安慰劑對照,Ad-GFP組大鼠尾靜脈注入1ml2.5×1010pfu的Ad-GFP作為腺病毒對照,Ad-DN-JNK1組大鼠尾靜脈注入1ml 2.5×1010pfu的Ad-DN-JNK1作為治療組。12w末隨機從各組抽取8只大鼠行鉗夾技術(shù)檢測胰島素抵抗(IR)情況,各組余下8只大鼠門靜脈采血生物化學(xué)法檢測空腹血糖(FBS)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)；放射免疫法檢測空腹胰島素(FIns)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a),分光光度計測定游離脂肪酸(FFAs);制備肝勻漿測定TG、TC、FFAs(檢測方法同上),分光光度計法檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)；另取部分肝組織行Western Blot技術(shù)檢測肝組織c-jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase-1, JNK1)、胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)蛋白表達和胰島素受體底物1絲氨酸307磷酸化(phospho-IRS-1 Ser307,p-IRS-1 Ser307)、蛋白激酶B絲氨酸473磷酸化(phospho-PKBSer473,p-PKBSer473)水平。部分肝組織行HE染色、蘇丹Ⅳ染色,光鏡下評定肝臟脂肪變性情況。 結(jié)果：第8w末高脂組大鼠已構(gòu)建成單純性脂肪肝IR模型。與NG12w大鼠比較,HG12w和Ad-GFP組的體重、肝指數(shù)、血清ALT、AST、TG、TC、FFAs、FIns、TNF-a及肝勻漿TG、TC、FFAs、MDA均明顯升高,肝勻漿SOD降低；葡萄糖輸注率(GIR)降低；肝組織JNK1蛋白表達、p-IRS-1Ser307水平增高,p-PKBSer473水平降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。Ad-DN-JNK1組與HG12w及Ad-GFP組大鼠分別比較上述各項指標,Ad-DN-JNK1組的體重、肝指數(shù)、血清ALT、AST、TG、TC、FFAs、FIns、TNF-a及肝勻漿TG、TC、FFAs、MDA均明顯降低,肝勻漿SOD升高；GIR升高；肝組織JNK1蛋白表達、p-IRSlSer307水平降低,p-PKBSer473水平升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。Ad-DN-JNK1組與NG12w組比較,體重、肝指數(shù)、AST、FIns、GIR水平、JNK1蛋白表達、p-IRS1Ser307、p-PKBser473水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05),其余血清學(xué)及肝勻漿指標差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。各組間兩兩比較IRS-1和PKB蛋白表達,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；HG12w與Ad-GFP組比較血清和肝勻漿各項指標以及JNK1、INS信號通路蛋白表達及磷酸化水平,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p值均0.05)。HG12w及Ad-GFP組大鼠均進展為非酒精性脂肪性肝炎(non alcoholic steatohepatitis, NASH);而Ad-DN-JNK1組大鼠肝臟脂肪變性明顯改善,未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。 結(jié)論：腺病毒載體是安全有效的基因治療載體,應(yīng)用Ad-DN-JNK1治療SD大鼠NAFLD,可明顯改善NAFLD,其作用機制可能為：Ad-DN-JNK1抑制JNK1活性后,下調(diào)p-IRS-1Ser307水平,升高其下游p-PKBSer473水平,進而促進INS信號傳導(dǎo),減弱IR,并降低TNF-α、FFAs水平,減少氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕肥胖和肝臟脂肪變性,最終改善NAFLD。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.5
【圖文】：

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表達和p·IRs一l知07、P-pKB洲73水平，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p值均 >0.05)。各組間兩兩比較IRS一1和PKB蛋白表達，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p值均 >0.05)，見圖2一1至24。鵝HGZ，HG4，HG日，HG12，HG16，JN【1哪哪粉{娜翻腳輝茸娜徽甲明娜降繃腳戶一今沙…46kdP-IRS一15.，，.，17OkdIRS一1170七dP-P【廣t弓7

卜側(cè)側(cè)奧鑄蓄炸粵0階﨑男甲s國曰奴圖2一3各組不同時期大鼠肝組織p.IRs一lser307水平注:與同期NG比較知 <0.05;HG各組間比較與 <0.05.lw.2，04份口8份.12w.16w卜內(nèi)奧書側(cè)側(cè)蓄斗妞!﨑鉆留么圖2一4各組不同時期大鼠肝組織p一P拙旋r4”水平注:與同期NG比較知<0.05;HG各組間比較乍 <0.052.3.2肝組織JNKI蛋白表達與lR水平相關(guān)性分析將HG大鼠第4w、行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn):sw、12w、16w末的GIR與肝組織JNKI蛋白相對灰度值進GIR與JNKI蛋白表達呈明顯負相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.931，P<0.01);即JNKI蛋白表達與IR水平呈正相關(guān)。

【參考文獻】

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本文編號：2755921