【摘要】： 目的: 構(gòu)建血管緊張素Ⅱ相關(guān)新基因BC097361的原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)BC097361基因的融合蛋白表達(dá),并對其進(jìn)行純化,制備兔抗BC097361融合蛋白多克隆抗體并進(jìn)行鑒定,從而探討該基因在肝纖維化發(fā)生中的作用。 方法: 1.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription PCR,RT-PCR)技術(shù),以大鼠肝星狀細(xì)胞系LX02細(xì)胞提取的總RNA為模板,擴(kuò)增目的基因BC097361,克隆至pGEM-T載體,測序正確后將目的基因插入原核表達(dá)載體pET-32a(+)中,并使其與載體中的His標(biāo)簽在同一讀碼框內(nèi),轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),并通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析、免疫印跡Western blotting分析證實融合蛋白表達(dá)的特異性。再利用親和層析法對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化及柱上復(fù)性。 2.純化的His-BC097361融合蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得抗該融合蛋白的多克隆抗體。以純化的融合蛋白為抗原,同時以免疫前后的兔血清作為一抗,利用Western blotting技術(shù)和ELISA方法對多克隆抗體進(jìn)行特異性和效價檢測。 3.選用鑒定正確的多克隆抗體以免疫組織化學(xué)方法和Western blotting方法分別檢測BC097361蛋白在大鼠肝纖維化組織中的表達(dá)以及分析在血管緊張素Ⅱ刺激下LX02細(xì)胞中BC097361相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建BC097361的原核表達(dá)載體pET-32a(+)-BC097361,轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)BC097361融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析得到證實。 2.純化BC097361融合蛋白并成功制備兔抗BC097361多克隆抗體。ELISA檢測證實該抗體效價＞1:320000,Western blotting、免疫組織化學(xué)檢測證明該抗體有較好的特異性。 3.利用多克隆抗體行Western blotting檢測及免疫組織化學(xué)技術(shù)證實:血管緊張素Ⅱ作用的LX02細(xì)胞及大鼠肝纖維化組織中BC097361相關(guān)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。 結(jié)論: 1.利用大腸埃希菌BL21(DE3)可以成功表達(dá)BC097361蛋白。 2.純化的BC097361融合蛋白免疫新西蘭兔,獲得高特異性、高效價多克隆抗體,為今后研究該蛋白的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。 3.血管緊張素Ⅱ作用的LX02細(xì)胞和大鼠肝纖維化組織中均可檢測到BC097361蛋白的表達(dá)明顯增加。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2
【圖文】：

A260/A280二2.01，非刺激組濃度2397.0657召g/ml， A26o/A280=2.04，l%瓊脂糖凝膠電泳可見總RNA為285、185、55三條目的帶，證實總RNA質(zhì)量完全滿足進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄條件的要求(圖1一2)。2.目的基因BC097361的擴(kuò)增以逆轉(zhuǎn)錄合成LX02細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行BC097361序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并拍照(圖1一3)，結(jié)果可見顯示清晰的目的條帶，大小約 897bp。2000bPIO00bP750bP500bP250bPIO0bP2000bP1000bP750bP500bP897bP250bP100bP圖1一ZmRNA電泳圖譜1:未刺激的LX02細(xì)胞 2:Ang11刺激36h的LXoZ細(xì)胞 M:DNAmarker圖1一 3BCO97361基因PCR擴(kuò)增圖 l:BC097361PCR擴(kuò)增結(jié)果 M:DNAmarker3.成功構(gòu)建pE不32a(+)一BCo97361重組質(zhì)粒pGEM一T-BCo97361重組質(zhì)粒雙酶切(EcoRI和 Hind111)后，得到預(yù)期大小 897bp的目的片段(圖1一4)，并連接到用相同的EcoRI和HindJJJ酶切的pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BLZI感受態(tài)，提取質(zhì)粒后再次酶切鑒定結(jié)果正確(兩條帶分別為5881bP和897bp)(圖1一5)

pGEM一T-Bco97361重組質(zhì)粒雙酶切電圖1一5pE下犯a(+)一BCo97361重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶

50KD圖1一 8pET-32a(+)一BCo97361重組菌大量誘導(dǎo)后分次洗滌結(jié)果l:pE下32a(+)一BCo97361非誘導(dǎo)組2:pE下32a(+)一Beo97361大量誘導(dǎo)組3:a(pE不犯a(+)一Beo97361大量誘導(dǎo)超聲碎菌后上清)4:bl(洗滌液洗滌一次后上清)5:b2(洗滌液洗滌二次后上清)6:b3(洗滌液洗滌三次后上清)7:cl(ddHZO液洗滌一次后上清)8:eZ(ddHZO液洗滌二次后上清)9:d(8M腮溶解包涵體離心后上清)10:Marker(標(biāo)準(zhǔn)同前)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 馬慧,王豪,孫焱,郭芳,房繼蓮,邵杰,饒慧瑛,王劍,魏來;失代償期肝硬化患者的終末期肝病模型預(yù)后分析[J];中華肝臟病雜志;2005年06期

2 申鳳俊,朱躍科,賈繼東,馬紅,王寶恩;纈沙坦抗大鼠肝纖維化療效及機(jī)制的研究[J];中華肝臟病雜志;2004年10期

3 魏紅山,李定國,陸漢明,展玉濤,王志榮,黃新,潘勤,徐芹芳;血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑抗肝纖維化的實驗研究[J];中華肝臟病雜志;2000年05期

本文編號：2755168