【摘要】： 乙型肝炎是一種在全球范圍內(nèi)流行的肝臟疾病,尤其在發(fā)展中國(guó)家。盡管目前HBV感染機(jī)制的研究得到較大的發(fā)展,但其成果主要集中在HBV感染與免疫系統(tǒng)的關(guān)系上,而HBV感染對(duì)宿主細(xì)胞的影響目前尚不清楚。越來(lái)越多的證據(jù)表明,HBV病毒對(duì)于肝細(xì)胞蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用,不同的病毒蛋白組合將產(chǎn)生不同的影響。另一方面,由HBV誘導(dǎo)的差異變化蛋白還可能打破機(jī)體的免疫耐受,使機(jī)體產(chǎn)生免疫識(shí)別而形成自身抗體。本研究旨在進(jìn)一步探討HBV病毒對(duì)肝細(xì)胞蛋白質(zhì)譜表達(dá)的影響,并比較不同HBV蛋白存在狀態(tài)下肝細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)變化的聯(lián)系和差異。同時(shí)利用雙向電泳和免疫印跡技術(shù)鑒定HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和HBV病人血清中針對(duì)肝細(xì)胞蛋白的自身反應(yīng)性抗體。 首先我們?cè)蛛x并比較了含有HBV全基因的HBV-Tg小鼠和對(duì)照小鼠肝細(xì)胞蛋白質(zhì)譜的差異。共有27個(gè)差異表達(dá)的蛋白被鑒定出,包括17個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白和10個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白。生物信息學(xué)分析得出,其中13個(gè)蛋白為參與代謝、三羧酸循環(huán)和氧化應(yīng)激的線粒體蛋白,表明肝細(xì)胞線粒體功能和氧化應(yīng)激受到影響。4個(gè)蛋白(SELENBP,SCP2,RGN和PRDX1)表達(dá)的差異在HBV慢性感染病人標(biāo)本中得到了確認(rèn)。結(jié)果還表明,HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中參與氧化應(yīng)激的重要基因(gpx、sod、ogg等)顯著上調(diào)。同時(shí),在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟線粒體中反應(yīng)性氧自由基產(chǎn)生明顯升高而ATP的產(chǎn)量顯著下調(diào)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞對(duì)于過(guò)氧化氫的毒性作用更加敏感。 本研究還比較了不同HBV蛋白存在狀態(tài)下肝細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)變化的異同。首先將HBs-Tg這種部分HBV基因轉(zhuǎn)入的小鼠與其對(duì)照小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明,共有20個(gè)蛋白發(fā)生變化,其中上調(diào)的蛋白16種,下調(diào)的蛋白4種。綜合分析HBV全基因轉(zhuǎn)入小鼠和部分基因轉(zhuǎn)入小鼠蛋白質(zhì)變化譜,發(fā)現(xiàn)在部分HBV基因轉(zhuǎn)入的小鼠中鑒定出所有20種差異蛋白中有16個(gè)蛋白的變化與HBV轉(zhuǎn)基因小鼠相吻合。 雙向電泳-免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBV-Tg小鼠和HBs-Tg小鼠血清中均存在自身抗體,在HBV-Tg小鼠血清中鑒定出8種自身抗體,其中有兩種(Etfa和Dmgdh)是質(zhì)譜鑒定出的在HBV轉(zhuǎn)基因鼠中過(guò)表達(dá)的蛋白。我們進(jìn)一步利用GO分析研究了這些自身反應(yīng)蛋白在細(xì)胞中的定位,發(fā)現(xiàn)8種蛋白中的7種定位于肝細(xì)胞的線粒體中。而HBs轉(zhuǎn)基因小鼠血清中鑒定出4種,其中3種與HBV轉(zhuǎn)基因小鼠相吻合。推廣至臨床樣本中我們同樣發(fā)現(xiàn)HBV感染病人血清中存在自身抗體并成功鑒定出9種,其中3種(ECSH1、ALB和GLUD)與小鼠模型相一致,而抗-GLUD抗體更是在大規(guī)模樣本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了較高的頻率(5/30)成為潛在的HBV臨床診斷治療的靶點(diǎn)和標(biāo)志。 綜上所述,本研究首次對(duì)比了HBV基因轉(zhuǎn)入的哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞與野生型肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)組差異,并進(jìn)一步的驗(yàn)證了生物信息學(xué)的分析結(jié)果。同時(shí)進(jìn)行了HBV轉(zhuǎn)基因小鼠以及HBV病人的血清組學(xué)分析,為了解HBV病毒對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響和機(jī)體對(duì)這些影響的反應(yīng)提供了很好的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟病理組織學(xué)變化及膠原沉積現(xiàn)象在野生型小鼠中，肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰無(wú)異常。肝細(xì)胞排列規(guī)則，以中央靜脈心呈輻射狀分布。但是HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟則處于一種病理狀態(tài)，肝細(xì)列不規(guī)整，邊緣模糊，并存在輕微的脂肪變性(圖2.2A)。利用Masson染可以看出HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝臟中已經(jīng)出現(xiàn)膠原的沉積現(xiàn)象(圖2.2B)，這種代表肝臟纖維化的傾向。然而有趣的是，我們并沒(méi)有在HBV轉(zhuǎn)基因鼠的肝觀察到明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。這也就表明這種小鼠的發(fā)病并不是由自身系統(tǒng)的攻擊造成的，其中可能存在其它的機(jī)制。2HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的分離和形態(tài)分析采用兩步法肝臟原位灌流技術(shù)可分離獲得高純度和活力的小鼠肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)

圖2.3.C57BL/6小鼠肝朋肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離結(jié)果Figure.ZJThecharaetersoftheisolatedhePatoeytes.(A)FreshlyPL:nfiedhePatoeytesw，thoutet一ltLire200“.(B)MostlsolatedcellswerePl一AnnexlnV一eells.(C)ImagesofmousehePatocytesIneulturefromohto96h.進(jìn)一步的，我們分離并培養(yǎng)了HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和BALB/。小鼠肝細(xì)胞(0一96h)。從形態(tài)土，一幾者并無(wú)顯著區(qū)別(圖2.3C)。2.2.3HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠肝細(xì)胞雙向凝膠電泳分析山于在病理分析中發(fā)現(xiàn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠存在著慢性損傷現(xiàn)象，l(lJ在形態(tài)!幾未見(jiàn)HBV車專基因小鼠肝細(xì)胞明顯變化。為f揭示HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在發(fā)凈丙’，’一期的機(jī)制，我們對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因鼠與野生型小鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞「}，蛋自的表達(dá)界一異進(jìn)行r分析。采川雙向電泳技術(shù)對(duì)兩種小鼠(n=4)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞總蛋自進(jìn)行展示〕侮一個(gè)蛋自樣‘W，至少進(jìn)行四次獨(dú)億的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)考，今斯亮藍(lán)染色后，可見(jiàn)的蛋自點(diǎn)在侮次實(shí)驗(yàn)中均能達(dá)到800個(gè)以卜，;幣門_多次試驗(yàn)中獲得J’較高的重現(xiàn)率。我們使用PDQuest7.10雙向電泳圖像分析軟件對(duì)這些點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，有34個(gè)蛋自點(diǎn)的表達(dá)墩差異(，幼/低)

Bv轉(zhuǎn)基因小鼠差異蛋白的生物信息學(xué)分析。2.6.Subeellularloeal讓ationandfunctionaleategorydistributioedProtoins.(A)Cellularloealizationand(B)moleeularfunetiondesindifferentcategories(ratioofrelativeProPortionineacheategoionofallidentities).激功能的變化將是HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟特點(diǎn)之一。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2754773