【摘要】： 目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是長期大量飲酒所致的肝臟損害性病變,其病理改變包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化。關于ALD的發(fā)病機理目前尚不清楚,近年來有人提出以氧化應激和脂質過氧化為中心的“二次打擊”假說,“第一次打擊”使脂類沉積在肝細胞,導致脂肪肝,“第二次打擊”涉及內毒素、細胞因子參與的氧化應激和脂質過氧化。氧化應激和內毒素是ALD發(fā)病過程中不可分割的兩個中心環(huán)節(jié),二者均可激活Kupffer細胞,活化的Kupffer細胞通過產生氧自由基和分泌細胞因子招募中性粒細胞、淋巴細胞浸潤引起肝內炎癥反應參與ALD的發(fā)病。解偶聯(lián)蛋白(uncoupling proteins, UCPs)是線粒體內膜上可以調節(jié)質子跨膜轉運的載體蛋白,具有解偶聯(lián)活性。目前共發(fā)現(xiàn)5種亞型,分別為UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5,其中UCP2雖無組織特異性,但在正常肝組織中僅在Kupffer細胞表達,肝細胞無表達或表達水平很低,當肝組織受損時,肝細胞則大量表達UCP2。UCP2可以通過調節(jié)質子跨膜轉運參與能量消耗和脂質代謝,可能參與ALD的氧化應激與脂質過氧化。本研究旨在應用酒精灌胃建立大鼠ALD模型,用免疫組織化學染色及逆轉錄聚合酶鏈反應( reverse transcription- polymerase chain reaction, RT-PCR)的方法觀察UCP2蛋白及UCP2 mRNA的表達情況,探討UCP2在ALD發(fā)病過程的表達及意義,為有效防治ALD提供新的思路。 方法:選用雄性健康清潔級Wister大鼠50只,體重200±20g,正常飼養(yǎng)1周后隨機分出10只為正常對照組,其余動物采用逐漸增加酒精濃度(濃度30%-60%,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法酒精灌胃,分別于4周、8周、12周和16周末隨機處死動物8只、8只、8只和9只,留取血清及肝組織標本并制備10%的肝勻漿,應用日本OLYMPUS AU-600全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT),天冬氨酸氨基轉移酶( aspartate aminotransferase, AST )和乙酰膽堿酯酶(cholinesterase, CHE);應用比色法檢測肝勻漿肝組織蛋白含量,以g(mg)為單位分別測定肝勻漿甘油三酯(triglyceride, TG )、氧自由基( oxygen free radical, OFR )、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的含量;應用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法檢測血清白細胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α);取部分肝組織立即冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色,觀察肝細胞脂變性情況;另取肝組織固定于4%中性福爾馬林溶液,石蠟包埋,5μm切片行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察肝組織的普通病理改變,天狼紅染色觀察肝組織纖維化程度,DPAS染色觀察肝組織Kupffer細胞的變化;并用石蠟切片進行UCP2免疫組織化學染色,觀察肝組織UCP2蛋白表達情況;余肝組織經液氮速凍后置于-80℃冰箱,用RT-PCR觀察大鼠肝組織UCP2 mRNA的表達。 結果:1血清生化指標的變化:隨著造模時間的延長,血清ALT和AST水平逐漸升高,CHE逐漸降低,與正常對照組比較P0.05或P0.01。 2血清細胞因子水平的變化:隨著造模時間的延長,血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量逐漸升高,與正常對照組比較P0.05或P0.01。 3肝組織勻漿氧化應激指標的變化:隨著造模時間的延長,肝組織勻漿TG、OFR及MDA含量逐漸升高,SOD含量逐漸降低,與正常對照組比較P0.05或P0.01。 4肝組織病理學改變:4周大鼠肝細胞出現(xiàn)小葉中央靜脈周圍肝細胞脂肪變性,隨著造模時間的延長,肝細胞脂肪變性逐漸加重,肝小葉內壞死灶明顯增多和纖維組織增生,16周大鼠肝細胞呈現(xiàn)彌漫小泡性脂肪變性,竇周纖維化,匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成。冰凍切片蘇丹Ⅳ染色顯示正常對照組大鼠肝組織無脂肪變性,模型4周組大鼠肝細胞胞漿中出現(xiàn)少量紅色脂滴,隨著造模時間延長,紅色脂滴逐漸增多,至16周表現(xiàn)為大量紅色脂滴分布于肝細胞內。天狼紅染色顯示模型4周組大鼠肝組織無明顯纖維組織增生,模型12周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯竇周纖維化和纖維化間隔形成趨勢,模型16周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯纖維間隔。5 Kupffer細胞的變化:肝組織DPAS染色顯示正常對照組肝組織匯管區(qū)存在少量DPAS陽性細胞,模型4周組大鼠肝小葉Ⅰ帶DPAS陽性細胞增多,隨著造模時間的延長陽性表達明顯增強,模型16周組大鼠整個肝小葉內竇周散在分布DPAS陽性細胞,胞漿豐富,體積肥大。 6免疫組化法檢測大鼠肝組織UCP2蛋白的表達:光鏡下,正常組大鼠肝臟內僅表達少量UCP2蛋白,隨著造模時間的延長陽性表達逐漸增強,主要表達于肝細胞胞漿內。 7 RT-PCR法檢測UCP2 mRNA的表達量:正常組大鼠肝組織中僅表達少量UCP2 mRNA,隨著造模時間的延長,其表達量逐漸增加,與正常對照組比較P0.05。 8肝組織中UCP2的相對表達量與血清ALT、AST水平呈正相關,相關系數(shù)分別為0.38和0.63,P值分別為P0.05和P0.01,與CHE呈負相關,相關系數(shù)為-0.43,P0.01。 9肝組織中UCP2的相對表達量與血清細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平呈正相關,相關系數(shù)分別為0.85,0.75和0.70,P值均0.01。10肝組織中UCP2的相對表達量與肝勻漿中氧化指標TG、OFR和MDA的含量呈正相關,相關系數(shù)分別為0.75、0.74和0.73,P值均0.01,與抗氧化指標SOD呈負相關,相關系數(shù)為-0.55,P0.01。 結論:1應用逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型,該模型肝臟病變如脂肪變性、炎癥反應和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變。 2 ALD發(fā)病過程中存在氧化應激,氧化應激參與ALD的發(fā)病過程。 3 ALD發(fā)病過程中存在Kupffer細胞的活化與增生,活化的Kupffer細胞參與炎癥反應和氧化應激,在ALD發(fā)病過程中的發(fā)揮重要作用。 4 ALD發(fā)病過程中UCP2表達逐漸增強,高表達的UCP2與血清促炎性細胞因子變化呈正相關,是影響ALD肝臟炎癥損傷的重要因素之一;高表達的UCP2還與肝臟氧化應激指標呈正相關,參與ALD中的氧化應激和脂質過氧化反應。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R575

【參考文獻】

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1 范建高,丁曉東,王國良,徐正婕,田麗艷,鄭曉英;非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟解偶聯(lián)蛋白2表達及其與能量貯備的關系[J];中華肝臟病雜志;2005年05期

本文編號：2753916