發(fā)布時(shí)間：2020-07-12 03:49

【摘要】：前言 據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全世界的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者中，我國(guó)約占一半。對(duì)慢性乙型肝炎的基礎(chǔ)研究和臨床診療一直是我國(guó)重點(diǎn)。以往對(duì)HBV的研究主要集中在血清學(xué)方面，由于HBV在血清和肝組織中其病毒狀態(tài)、抗原的含量、血清型和基因型、病變程度等方面均存在顯著差異，難以直觀地反應(yīng)病變的狀態(tài)和嚴(yán)重程度，所以肝活體組織檢查越來越成為必要手段，在診斷潛在病變和早期纖維化，最終診斷或除外HBV感染方面有著不可替代的作用。目前，肝穿刺活檢已相當(dāng)普遍，但對(duì)肝穿刺結(jié)果的判定、各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)之間的相互關(guān)系及和預(yù)后的聯(lián)系，還缺乏系統(tǒng)性評(píng)估。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病毒變異在HBV致病與致癌中的作用越來越引起關(guān)注，特別是X基因及其蛋白。X基因是HBV基因組內(nèi)功能重疊最明顯的區(qū)域，其編碼的X蛋白具有廣泛的反式激活作用，目前被認(rèn)為是研究HBV致病與致癌作用機(jī)制的突破口。以往對(duì)X基因及蛋白變異的研究多采用血清標(biāo)本或在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，與體內(nèi)肝細(xì)胞中的實(shí)際情況有一定差距。肝組織內(nèi)X基因的變異與各組織病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系以及對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的影響還未見報(bào)道。 近年來，在對(duì)肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制的研究中，抑癌基因啟動(dòng)子的高甲基化越來越引起人們的關(guān)注。雖然許多研究證實(shí)，肝細(xì)胞癌中p16~(INK4A)的高甲基化可被普遍檢出，且HBV感染能顯著增加肝組織p16~(INK4A)甲基化比率，從而使p16蛋白低表達(dá)或不表達(dá)，在肝細(xì)胞癌形成早期起了重要作用，但其中的機(jī)制并不明確。最新體外研究提示，HBV的病毒蛋白和病毒變異可能與此過程有關(guān)，但在人體條件下這種相關(guān)性是否存在，結(jié)果也有待進(jìn)一步證實(shí)。 本研究一方面以較大臨床肝穿刺樣本作為研究對(duì)象，通過對(duì)慢性乙型肝炎組織病理學(xué)指標(biāo)(如Scheuer評(píng)分、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)和X蛋白(HBx蛋白)的原位表達(dá)，單位肝組織內(nèi)HBV DNA含量)和X基因變異的回顧性研究，明確它們之間的相互關(guān)系及與患者預(yù)后的聯(lián)系，找到可用于肝穿刺活檢的病理輔助診斷指標(biāo)，對(duì)慢性乙型肝炎患者的預(yù)后加以評(píng)估及指導(dǎo)臨床診療；另一方面在組織水平研究了HBV病毒蛋白(包括HBsAg、HBcAg和HBx蛋白)以及X基因的變異與p16~(INK4A)甲基化 之間的關(guān)系，為HBV介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌形成機(jī)理的研究提供新方向。 第一部分 HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標(biāo)和慢性乙型肝炎患者預(yù)后的相關(guān)性研究 目的：通過對(duì)慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中組織病理學(xué)指標(biāo)和患者預(yù)后的回顧性研究，明確各指標(biāo)間的相互關(guān)系及和患者預(yù)后的聯(lián)系。 方法：對(duì)216例肝穿刺活檢病例進(jìn)行預(yù)后隨訪，時(shí)間為2～18年。根據(jù)隨訪結(jié)果，按有無肝細(xì)胞癌的發(fā)生首先將患者分為兩組：癌變組和非癌變組；非癌變組患者又按有無肝硬化的發(fā)生分為硬化組和非硬化組；最后非硬化組患者按血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平分為ALT波動(dòng)組和ALT正常組。肝臟病理損傷程度用Scheuer評(píng)分來表示；免疫組化En Vision二步法檢測(cè)肝組織HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)單位肝組織內(nèi)HBV DNA的含量。 結(jié)果：相關(guān)分析結(jié)果顯示：肝組織內(nèi)HBeAg的表達(dá)與慢性肝炎炎癥分級(jí)(G分級(jí))呈顯著正相關(guān)(P=0.001)；HBx蛋白的表達(dá)與G分級(jí)(P=0.008)和纖維化分期(S分期)(P=0.002)均呈顯著正相關(guān)。部分指標(biāo)預(yù)后組間也存在差異：硬化組G分級(jí)顯著高于非硬化組(P=0.000)，ALT波動(dòng)組顯著高于ALT正常組(P=0.019)；同樣，硬化組S分期也顯著高于非硬化組(P=0.000)，ALT波動(dòng)組顯著高于ALT正常組(P=0.001)；肝組織內(nèi)HBeAg(P=0.005)和HBx蛋白(P=0.024)的表達(dá)在硬化組明顯比非硬化組高。方差分析結(jié)果還顯示HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響具有協(xié)同作用：同一病例中兩者肝組織內(nèi)同時(shí)表達(dá)將大大增加慢性乙型肝炎患者肝硬化的發(fā)生率達(dá)38.46％，而單一HBeAg或HBx蛋白表達(dá)者為15.07％，兩者均陰性者僅為10.81％。多元參數(shù)的最優(yōu)尺度回歸則顯示Scheuer評(píng)分是最重要的判斷預(yù)后的指標(biāo)。 結(jié)論：肝組織內(nèi)HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)與慢性乙型肝炎患者肝臟病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，并顯著增加肝硬化的發(fā)生率；Scheuer評(píng)分是判斷患者預(yù)后的最重要指標(biāo)，其分值越高則患者預(yù)后越差。 第二部分 HBV X基因變異與HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標(biāo)和慢性乙型肝炎患者預(yù)后的相關(guān)性研究 目的：研究慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)HBV X基因部分區(qū)段的變異與各組織病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，及其在預(yù)后轉(zhuǎn)歸(特別是肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生)中的作用。 方法：選取1986～1994年間有完整預(yù)后隨訪資料的83例慢性乙型肝炎肝穿刺活檢病例作為研究對(duì)象�；颊甙从袩o肝細(xì)胞癌和肝硬化的發(fā)生分為3組：癌變組、 硬化組和非硬化組。另取20例HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌作為對(duì)照研究。從福爾馬林固定、石蠟包埋組織中抽提DNA，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HBV X基因nt1583～1793區(qū)段，目的條帶經(jīng)膠回收后直接雙向測(cè)序。免疫組化En Vision二步法顯示肝組織內(nèi)HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)單位肝組織HBV DNA含量；數(shù)據(jù)處理采用序列分析軟件和統(tǒng)計(jì)軟件。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)211bp，核苷酸突變發(fā)生于：nt1632、1633、1635、1636、1652、1673、1674、1719、1726、1727、1730、1752、1762和1764位點(diǎn)，其中錯(cuò)義突變主要出現(xiàn)在X蛋白aa87(nt1632、1633)、88(nt1635、1636)、116(nt1719)、118(nt1726、1727)、119(nt1730)、127(nt1752)、130(nt1762)和131(nt1764)位氨基酸。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，檢測(cè)區(qū)段核苷酸突變率和患者慢性乙型肝炎病史呈顯著正相關(guān)(P=0.005)，肝癌病例的突變率顯著高于慢性肝炎(P=0.009)；nt1725～1730(aa118／119)突變與肝組織內(nèi)HBcAg顯著低表達(dá)(P=0.006)，和HBV DNA低拷貝數(shù)(P=0.004)明顯相關(guān)，尤以ACTGAC(TD)型突變最為明顯；相反nt1762／1764(aa130／131)位點(diǎn)突變則伴肝組織內(nèi)HBcAg顯著高表達(dá)(P=0.005)和高水平的HBV DNA含量(P=0.006)。硬化組和非硬化組中各位點(diǎn)野生型和突變型所占比率均未見顯著性差異；但癌變組nt1762／1764(aa130／131)突變率顯著高于非癌變患者(P=0.011)；nt1725～1730(aa118／119)野生型(P=0.024)和nt1762／1764(aa130／131)突變型(P=0.001)在肝癌組所占比率均明顯高于慢性肝炎。 結(jié)論：nt1725～1730(aa118／119)和nt1762／1764(aa130／131)突變可能與肝組織內(nèi)HBcAg的表達(dá)和HBV的復(fù)制有關(guān)。HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌中病毒以高復(fù)制型存在。HBV的突變是一個(gè)逐漸累積的過程，突變和肝硬化的發(fā)生無關(guān)，而nt1762／1764(aa130／131)突變能顯著增加慢性乙型肝炎患者肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)率。 第三部分 HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標(biāo)和X基因變異與p16~(INK4A)甲基化的相關(guān)性研究 目的：通過研究HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標(biāo)及X基因的變異與p16~(INK4A)甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系，明確病毒對(duì)p16~(INK4A)甲基化的影響和其在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌形成中的作用。 方法：選取23例HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌和25例慢性乙型肝炎肝穿刺活檢病例作為研究對(duì)象，癌與癌旁組織以及肝穿組織中p16~(INK4A)的甲基化狀態(tài)采用甲基化特異性PCR(MSP)進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化En Vision二步法顯示肝組織內(nèi)HBsAg、 HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)單位肝組織HBVDNA含量。HBV X基因的變異用PCR擴(kuò)增和直接序列測(cè)定來檢測(cè)。 結(jié)果：在癌旁組織(P=0.025)和慢性乙型肝炎(P=0.029)病例中，存在p16~(INK4A)甲基化的病例其肝組織內(nèi)HBx蛋白的表達(dá)明顯高于非甲基化病例。但在肝癌組織中，HBx蛋白的表達(dá)與p16~(INK4A)甲基化無關(guān)。在所有肝組織中，HBsAg、HBcAg和組織HBV DNA含量均與p16~(INK4A)甲基化狀態(tài)無關(guān)。 結(jié)論：在癌前病變中，p16~(INK4A)甲基化與HBx蛋白高表達(dá)顯著相關(guān)。提示HBx蛋白可能誘導(dǎo)p16~(INK4A)甲基化而使該抑癌基因失活，在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌形成中起了重要作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

HBsAg在四種病毒蛋白中陽性率最高(145/216，67%)，染色也最強(qiáng)(Me瞰Sn0.9壯1.10)。鏡下陽性細(xì)胞可彌漫性、散在性或集落性分布，陽性著色大多位于胞質(zhì)，3例可見膜陽性，同一病例中胞膜與胞質(zhì)陽性可并存(圖1一1)。HBcAg陽性率為 41%(89/216)，多為胞質(zhì)中等程度著色(Mean出 SD0.6班 1.11)。13例HBcAg呈胞核陽性，余均為胞質(zhì)陽性，同一肝細(xì)胞的胞質(zhì)胞核可同時(shí)陽性(圖1一2)。HBeAg無論在陽性率 (56/216，26%)還是陽性強(qiáng)度上(Me艇 500.22士0.41)均最弱，多為匯管區(qū)炎癥反應(yīng)周圍少量肝細(xì)胞胞質(zhì)散在陽性(圖1一3)。HBx蛋白表達(dá)陽性率為 49%(106/216)，著色均位于胞質(zhì)，中等強(qiáng)度呈顆粒狀(Mean士SD0.73士 1.00)。在炎性壞死比較明顯的匯管區(qū)HBx蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明HBx蛋白的表達(dá)與匯管區(qū)炎癥活動(dòng)有關(guān)(圖1一4)。圖1一1:HBsAg在慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中的表達(dá)。(A)肝細(xì)胞彌漫陽性，胞質(zhì)呈顆

圖1一:HBsAg在慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中的表達(dá)。(c)胞膜呈陽性表達(dá)。(D)在同一病例中胞膜表達(dá)與胞質(zhì)表達(dá)并存。(免疫組化 EnVision二步法400倍)圖1魂:HBcAg在慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中的表達(dá)。(A)陽性染色位于細(xì)胞核。(B)同一肝細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)均呈陽性染色。(免疫組化 EnVision二步法400倍)圖1一:HBeAg在慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中的表達(dá)。(A)呈散在弱陽性胞質(zhì)表達(dá)。(B)陽性肝細(xì)胞位于炎癥反應(yīng)明顯的匯管區(qū)。(免疫組化 EnVision二步法400倍)

遙豁吩卜廠尹圖1一:HBsAg在慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中的表達(dá)。(c)胞膜呈陽性表達(dá)。(D)在同一病例中胞膜表達(dá)與胞質(zhì)表達(dá)并存。(免疫組化 EnVision二步法400倍)圖1魂:HBcAg在慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中的表達(dá)。(A)陽性染色位于細(xì)胞核。(B)同一肝細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)均呈陽性染色。(免疫組化 EnVision二步法400倍)圖1一:HBeAg在慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中的表達(dá)。(A)呈散在弱陽性胞質(zhì)表達(dá)。(B)陽性肝細(xì)胞位于炎癥反應(yīng)明顯的匯管區(qū)。(免疫組化 EnVision二步法400倍)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳金軍,侯金林;乙型肝炎病毒X蛋白的產(chǎn)生和作用機(jī)理[J];病毒學(xué)報(bào);1999年01期

本文編號(hào)：2751377