【摘要】：目的：建立人臍血單個核細胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，用HBV感染人臍血單個核細胞，了解HBV在人臍血單個核細胞內的復制、分泌過程，進而建立起人臍血單個核細胞作為HBV感染的細胞模型，為探討和研究HBV宮內感染的分子機制及HBV垂直感染奠定基礎。 方法：在大理學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收集臍血，用EDTA做抗凝劑，采用Ficoll密度梯度離心法分離得到人臍血單個核細胞，苔盼藍染色結果表明活細胞比率達到98%。將臍血單個核細胞用RPMI1640培養(yǎng)液按照1×106/ml的密度接種在24孔細胞培養(yǎng)板中，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的動態(tài)變化。用病毒顆粒與臍血單個核細胞比約為100:1進行感染。在HBV感染人臍血單個核細胞后繼續(xù)培養(yǎng)15d，每天采用酶聯(lián)免疫法(ELSIA)對細胞培養(yǎng)上清液檢測乙肝病毒五項指標(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)，運用熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ-PCR)技術對細胞培養(yǎng)上清液和細胞內的HBV DNA進行定量檢測，確定HBV DNA感染的動態(tài)變化。結果：⑴臍血單個核細胞形態(tài)學的動態(tài)變化：臍血單個核細胞在培養(yǎng)15d內能維持正常的細胞形態(tài)與結構，絕大部分細胞懸浮生長，少量細胞貼壁生長。 ⑵ELSIA法檢測培養(yǎng)細胞上清液中乙肝五項指標：培養(yǎng)細胞上清液在第1d，HBsAg表現(xiàn)為陽性，第2d轉為陰性，隨后細胞培養(yǎng)至第7～10d時，HBsAg再次出現(xiàn)陽性，之后又轉為陰性，HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb在檢測中，均出現(xiàn)陰性結果。 ⑶熒光定量PCR法檢測HBV DNA：每天更換細胞培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA第1d可以檢出，第2～3d沒有檢測出，從第4天再次檢測出，且HBV DNA的拷貝數(shù)逐漸升高，在第9d開始呈下降趨勢，第13d已檢測不出來，HBV DNA拷貝數(shù)的變化曲線接近呈倒“V”形；不更換細胞培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA含量逐漸升高HBV DNA拷貝數(shù)的變化曲線呈“S”形；培養(yǎng)細胞中的HBV DNA在第1至第3d，細胞內并沒有檢測出HBV DNA，從第4d開始，可以檢測得到HBV DNA，在第9d，細胞內HBV DNA的含量達到最大，隨著細胞培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞內HBVDNA的含量逐漸降低。培養(yǎng)細胞中的HBV DNA的拷貝數(shù)變化曲線呈倒“V”形。 結論：⑴建立了人臍血單個核細胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)； ⑵人臍血單個核細胞可作為HBV感染的細胞模型； ⑶FQ-PCR法比ELSIA法能更好的確認標本中HBV存在。
【學位授予單位】：大理學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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本文編號：2750952