【摘要】：目的：建立人臍血單個(gè)核細(xì)胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，用HBV感染人臍血單個(gè)核細(xì)胞，了解HBV在人臍血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、分泌過(guò)程，進(jìn)而建立起人臍血單個(gè)核細(xì)胞作為HBV感染的細(xì)胞模型，為探討和研究HBV宮內(nèi)感染的分子機(jī)制及HBV垂直感染奠定基礎(chǔ)。 方法：在大理學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收集臍血，用EDTA做抗凝劑，采用Ficoll密度梯度離心法分離得到人臍血單個(gè)核細(xì)胞，苔盼藍(lán)染色結(jié)果表明活細(xì)胞比率達(dá)到98%。將臍血單個(gè)核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液按照1×106/ml的密度接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的動(dòng)態(tài)變化。用病毒顆粒與臍血單個(gè)核細(xì)胞比約為100:1進(jìn)行感染。在HBV感染人臍血單個(gè)核細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)15d，每天采用酶聯(lián)免疫法(ELSIA)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)乙肝病毒五項(xiàng)指標(biāo)(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)，運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(FQ-PCR)技術(shù)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，確定HBV DNA感染的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果：⑴臍血單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)學(xué)的動(dòng)態(tài)變化：臍血單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)15d內(nèi)能維持正常的細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)，絕大部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。 ⑵ELSIA法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清液中乙肝五項(xiàng)指標(biāo)：培養(yǎng)細(xì)胞上清液在第1d，HBsAg表現(xiàn)為陽(yáng)性，第2d轉(zhuǎn)為陰性，隨后細(xì)胞培養(yǎng)至第7～10d時(shí)，HBsAg再次出現(xiàn)陽(yáng)性，之后又轉(zhuǎn)為陰性，HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb在檢測(cè)中，均出現(xiàn)陰性結(jié)果。 ⑶熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA：每天更換細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA第1d可以檢出，第2～3d沒(méi)有檢測(cè)出，從第4天再次檢測(cè)出，且HBV DNA的拷貝數(shù)逐漸升高，在第9d開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，第13d已檢測(cè)不出來(lái)，HBV DNA拷貝數(shù)的變化曲線接近呈倒“V”形；不更換細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA含量逐漸升高HBV DNA拷貝數(shù)的變化曲線呈“S”形；培養(yǎng)細(xì)胞中的HBV DNA在第1至第3d，細(xì)胞內(nèi)并沒(méi)有檢測(cè)出HBV DNA，從第4d開(kāi)始，可以檢測(cè)得到HBV DNA，在第9d，細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的含量達(dá)到最大，隨著細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞內(nèi)HBVDNA的含量逐漸降低。培養(yǎng)細(xì)胞中的HBV DNA的拷貝數(shù)變化曲線呈倒“V”形。 結(jié)論：⑴建立了人臍血單個(gè)核細(xì)胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)； ⑵人臍血單個(gè)核細(xì)胞可作為HBV感染的細(xì)胞模型； ⑶FQ-PCR法比ELSIA法能更好的確認(rèn)標(biāo)本中HBV存在。
【學(xué)位授予單位】：大理學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2750952