【摘要】：背景與目的：急性肝損傷的特征是短時(shí)間內(nèi)肝細(xì)胞大量變性、壞死并伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其臨床治療成為棘手問(wèn)題。因病毒、藥物、細(xì)菌、酒精及遺傳等因素引起的急慢性肝臟疾病極大危害著人們的健康。目前公認(rèn)的治療急性重癥及中晚期肝病的最有效方法是肝移植，但因肝源不足、價(jià)格昂貴及移植后免疫排斥反應(yīng)等因素，應(yīng)用受到限制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）是來(lái)自中胚層的一群異質(zhì)細(xì)胞，自我復(fù)制能力強(qiáng)，并具有多向分化的潛能，在適宜的條件下可以分化為成骨、軟骨、脂肪細(xì)胞，甚至源于中胚層的心肌細(xì)胞、外胚層的神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞相比，BMSCs因其取材方便，在適當(dāng)條件下可大量擴(kuò)增、低免疫排斥、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議、花費(fèi)較低等特點(diǎn)成為組織工程和細(xì)胞治療的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)白酒一次性灌胃制備急性酒精性肝損傷大鼠模型，并用損傷肝臟組織勻漿培養(yǎng)第3代大鼠BMSCs，誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞方向分化，來(lái)探討B(tài)MSCs在病理微環(huán)境下向肝細(xì)胞分化的可行性，了解BMSCs治療急性肝臟疾病的可能機(jī)制，為BMSCs臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：（1）3～4周齡健康雄性SD大鼠，在LG-DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)體系下，采用完全貼壁法培養(yǎng)大鼠股骨、脛骨骨髓液獲得BMSCs，體外傳代；倒置相差顯微鏡下每日觀察BMSCs的生長(zhǎng)情況及其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；MTT法檢測(cè)第3、6代細(xì)胞并繪制生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD29、CD105的表達(dá)。（2）400～500g健康雄性SD大鼠10只，隨機(jī)分為肝損傷組及對(duì)照組，每組5只，禁食不禁水12h，肝損傷組以56°紅星二鍋頭一次性經(jīng)口灌胃10ml/kg(折合酒精4.5g/kg)，對(duì)照組給予同等量生理鹽水灌胃，24h后處死大鼠，取肝臟組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。（3）取正常及肝損傷組大鼠肝臟，分別按肝臟濕重0.1g加1ml低糖DMEM完全培養(yǎng)基的比例冰上研磨制備肝臟組織勻漿。用損傷肝勻漿誘導(dǎo)第3代BMSCs分化，正常肝勻漿做對(duì)照，在第0、3、7、10、14、21天用RT-PCR和western blot法檢測(cè)AFP、ALB的表達(dá)。 結(jié)果：（1）原代細(xì)胞72首次換液后可見(jiàn)散在分布的長(zhǎng)梭形細(xì)胞，之后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，在第8-9天融合，傳代細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，形態(tài)均一，呈漩渦狀、魚(yú)群狀生長(zhǎng)；生長(zhǎng)曲線示細(xì)胞第1-2天為潛伏期，4-6天為增殖期，生長(zhǎng)迅速，在第7-8天生長(zhǎng)緩慢進(jìn)入平臺(tái)期；細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD105，陰性表達(dá)CD34。（2）肝損傷組大鼠肝臟病理呈明顯肝脂肪變性，對(duì)照組肝臟組織形態(tài)正常。（3）在損傷及正常肝勻漿誘導(dǎo)下，兩組BMSCs均從長(zhǎng)梭形逐漸向多角形改變，第14天左右細(xì)胞出現(xiàn)肝細(xì)胞樣改變。兩組細(xì)胞均在第3天檢測(cè)到AFP的表達(dá)，表達(dá)量在第7天左右達(dá)到高峰后迅速下降，第14天時(shí)表達(dá)量極少；在第7天檢測(cè)到ALB的表達(dá)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增加，mRNA水平與蛋白水平表達(dá)一致。但損傷肝勻漿與正常肝勻漿誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)AFP和ALB的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 結(jié)論：（1）完全貼壁法培養(yǎng)骨髓液可獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，得到BMSCs純度較高，體外生長(zhǎng)活性強(qiáng)，增殖旺盛。（2）禁食12h后，56°紅星二鍋頭一次性灌胃染毒大鼠，可成功制備大鼠急性酒精性肝損傷模型。（3）急性酒精性肝損傷大鼠的肝臟組織勻漿可以誘導(dǎo)BMSCs向肝細(xì)胞方向分化，但誘導(dǎo)效果與正常肝臟組織勻漿相近。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R575
【圖文】：

態(tài) 學(xué)特 征h 后， 可 見(jiàn) 培 養(yǎng) 液中 懸 浮 著大 量 圓 形 細(xì)胞 ，換 液 2～ 72 h 首次 換液 后可 見(jiàn) 皿 底 散在 分 布著 長(zhǎng)梭 形 的 貼 壁 圓形 細(xì) 胞， 之 后細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 迅 速， 多 為 成 纖維 狀 細(xì)胞 放 射狀 生 長(zhǎng) ， 在 第 9 天左 右， 大 多數(shù) 細(xì)胞 克 隆 可 達(dá)傳 代 BM S Cs 分 布均 勻 （附 圖 3） ，形 態(tài) 均 一 ，多 為 渦狀 ， 傳代 細(xì) 胞 生長(zhǎng) 迅速 ， 2h 內(nèi) 可 貼壁 ，約 3 - 4 天， 細(xì) 胞 變得 寬 大 扁平 ， 生 長(zhǎng)速 度 減慢 （ 附 圖 4） 。 長(zhǎng)曲 線

原代培養(yǎng)BMSCs第3天（x40）Fig1PrimarycultureofBMSCsatthe3d（x40）圖2原代培養(yǎng)BMSCs第8天（x40）Fig2PrimarycultureofBMSCsatthe8d（x40）

圖 4 P 6 代 B M S C s（ x4 0 ）F ig 4 T h e 6 th p a ss a g e cu lt u re （ x4 0 ）圖5急 性酒 精性 肝 損 傷肝 臟組 織H E染 色（ x1 0 0）F ig 5 A cu t e a

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本文編號(hào)：2746067