【摘要】：肝纖維化(liver fibrosis)是一系列損傷因子作用后引起的一種可逆性性損傷后修復(fù)的過(guò)程,其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過(guò)度沉積。在當(dāng)今社會(huì),是一個(gè)預(yù)后極差且病死率很高的疾病,嚴(yán)重威脅著人類的健康。當(dāng)肝臟受到致病因子刺激時(shí),靜止?fàn)顟B(tài)的HSC被激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞增殖加快,膠原大量沉積。因此研究HSC增殖、凋亡以及遷移機(jī)制對(duì)研究肝纖維化具有重要意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指細(xì)胞由上皮表型轉(zhuǎn)化成為間質(zhì)表型。研究表明EMT與胚胎發(fā)育、纖維化、器官再生以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。EMT參與了靜息HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞表型HSC的過(guò)程。Goosecoid(GSC)屬于同源異型框(homeobox)轉(zhuǎn)錄因子,在原腸胚形成、耳泡的發(fā)育、乳腺癌細(xì)胞發(fā)生中,GSC作為組織者基因之一,均可誘導(dǎo)EMT,促進(jìn)細(xì)胞的遷移。目前,GSC已成為公認(rèn)的誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子,用于EMT的研究。GSC可誘導(dǎo)胚胎發(fā)育及腫瘤進(jìn)展相關(guān)的EMT,而其在器官纖維化相關(guān)EMT中的作用尚無(wú)報(bào)道。TGF-β是促進(jìn)肝纖維化的關(guān)鍵因素。在胚胎發(fā)育及腫瘤進(jìn)展中,TGF-β均可上調(diào)GSC的表達(dá),但GSC在肝纖維化中的作用尚不明確。目的:明確GSC在肝纖維化及HSC活化中的表達(dá)情況,研究GSC對(duì)HSC活化、增殖、凋亡及遷移的影響。為肝纖維化的治療提供新靶點(diǎn)。方法:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型作為模型組,腹腔注射Oil作為對(duì)照組,在體內(nèi)觀察肝纖維化中GSC的變化,通過(guò)HE染色觀察肝臟大體形態(tài),Masson染色觀察膠原變化,通過(guò)免疫組化法研究小鼠肝臟中α-SMA、Collagen I及GSC的表達(dá)。并用TGF-β刺激LX-2細(xì)胞活化,在體外觀察HSC活化后GSC的變化,在體外用小干擾RNA敲低HSC中GSC,用Westen blot分析、Real-time PCR方法觀察GSC和HSC活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I的表達(dá)變化,用CCK-8及Br Du摻入實(shí)驗(yàn)研究敲低GSC對(duì)HSC增殖的影響;用Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,并進(jìn)一步應(yīng)用Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP的活性及表達(dá),用劃痕實(shí)驗(yàn)研究敲低GSC對(duì)HSC遷移的影響。結(jié)果:1小鼠肝纖維化形成過(guò)程中GSC表達(dá)量升高HE結(jié)果顯示對(duì)照組:肝臟組織結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞沿中心靜脈呈放射狀排列,排列整齊,肝細(xì)胞大小、形態(tài)規(guī)則,無(wú)脂肪變性以及炎細(xì)胞浸潤(rùn);模型組中正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失,肝細(xì)胞排列紊亂,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson染色結(jié)果顯示模型組纖維結(jié)締組織明顯增多。IHC結(jié)果顯示,較對(duì)照組,模型組肝纖維化指標(biāo)α-SMA、Collagen I表達(dá)量增多,GSC表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,以上結(jié)果表明CCl4腹腔注射可誘導(dǎo)明顯的肝纖維化,并且在此過(guò)程中GSC表達(dá)量升高。2體外應(yīng)用TGF-β誘導(dǎo)HSC活化可上調(diào)GSC表達(dá)Western Blot分析結(jié)果顯示,用TGF-β干預(yù)人HSC細(xì)胞系LX-2后,HSC活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I的蛋白表達(dá)量較Control組顯著升高;同時(shí)GSC的蛋白表達(dá)量顯著升高。Real-time PCR結(jié)果顯示,與Control組相比,TGF-β干預(yù)組的HSC活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I的m RNA水平明顯升高;并且GSC的m RNA水平顯著升高。以上結(jié)果表明,GSC與HSC活化可能具有正相關(guān)關(guān)系。3體外應(yīng)用si RNA敲低GSC可抑制HSC活化Real-time PCR結(jié)果表明,si GSC轉(zhuǎn)染48 h后,GSC的m RNA水平明顯下降,轉(zhuǎn)染72 h后進(jìn)一步下降,表明GSC被有效敲低。與轉(zhuǎn)染si Control組相比,用si RNA敲低GSC后,HSC活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I m RNA水平顯著降低。Western Blot分析結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染si Control組相比,轉(zhuǎn)染si GSC后,HSC活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I的蛋白表達(dá)量顯著降低。表明GSC可促進(jìn)HSC活化。4敲低GSC抑制HSC增殖用si GSC轉(zhuǎn)染LX-2,CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染si Control組相比,轉(zhuǎn)染si GSC 72 h后,OD450值明顯降低。用Brd U摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA合成情況,評(píng)估細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染si GSC后,DNA合成明顯減少。提示GSC可促進(jìn)LX-2增殖。5敲低GSC不影響HSC凋亡Western Blot分析結(jié)果顯示,與si Control組相比,轉(zhuǎn)染si GSC后,凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的活性及PARP的表達(dá)無(wú)顯著變化;用Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si Control組與轉(zhuǎn)染si GSC組的凋亡細(xì)胞百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明GSC不影響HSC凋亡。6敲低GSC抑制HSC遷移功能細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在LX-2中,轉(zhuǎn)染si GSC組較轉(zhuǎn)染si Control組細(xì)胞劃痕愈合明顯減慢,提示GSC可能促進(jìn)HSC遷移。結(jié)論:1在肝纖維化形成及HSC活化中,GSC表達(dá)升高。2 GSC可促進(jìn)HSC活化、增殖及遷移。3 GSC不影響HSC凋亡。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2745577