【摘要】：1.研究背景及目的 乙型病毒性肝炎是一種世界性疾病,感染者可發(fā)展為慢性肝炎,最終導致肝硬化和肝癌。全國現(xiàn)有慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者約3000萬人其中約5%的患者將發(fā)展成為重型肝炎。一旦發(fā)展至重型肝炎,病人臨床救治成活率不足40%。做到早期發(fā)現(xiàn)、早期干預,對于防止肝炎重癥化的發(fā)生非常重要。因此,迫切需要找出早期預示疾病發(fā)生、監(jiān)測疾病發(fā)展和嚴重程度的敏感、可靠的指標。 我們前期基因芯片實驗發(fā)現(xiàn)在ConA誘導的小鼠肝炎模型中RCOR3表達有顯著差異。RCOR3是抑制元素-1沉默轉(zhuǎn)錄因子協(xié)阻抑因子(repressor element silencing transcription factor corepressor, CoREST)家族成員之一,其功能就是作為REST的協(xié)阻抑因子協(xié)助REST發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用,REST抑制功能的發(fā)揮依賴于RCOR3目前為止,未見到關于REST (RCOR3)與乙型肝炎的相關研究報道。 本研究旨在研究慢性乙型肝炎患者外周血RCOR3在不同病情狀態(tài)下的差異表達,并分析其與臨床炎癥損傷指標的相關性,并通過探析抗炎制劑對RCOR3的調(diào)控作用及其機制,揭示RCOR3參與慢性乙型肝炎的作用機制。 2.研究方法 2.1RCOR3在慢性乙型肝炎患者血清中的表達情況 采集22例慢性乙型肝炎輕度(CHB, Mild),34例慢性乙型肝炎中度(CHB, Moderate),47例慢性乙型肝炎重度(CHB, Severe),24例重型肝炎(SHB)以及34例健康對照者的外周血,分離血清后ELISA法檢測RCOR3水平,同時進行肝功能(ALT, AST, TB)檢測。 2.2動物實驗研究RCOR3的作用機制 2.2.1ConA制備的爆發(fā)性肝炎小鼠肝組織中RCOR3動態(tài)變化情況 根據(jù)小鼠體重按20mg/kg經(jīng)尾靜脈注射ConA制備肝損傷動物模型,正常對照組注射等量PBS。于Oh,1h,3h,6h摘眼球取血,處死小鼠取肝組織,生化及病理學檢查評估各組小鼠肝組織損傷程度。小鼠肝組織勻漿后抽提RNA, Q-PCR檢測RCOR3mRNA水平 2.2.2抗炎制劑(大黃素)對RCOR3的調(diào)控作用及其機制 (1)大黃素療效觀察 六周齡雄性Balb/c小鼠隨機分為正常對照組、大黃素組、模型組(ConA組)、治療組(12.5mg/kg+ConA組)。治療組按12.5mg/kg給予大黃素灌胃,2h后ConA尾靜脈注射,ConA組以CMC-Na(大黃素溶劑)代替大黃素,大黃素組以生理鹽水代替ConA,正常對照組不做處理。ConA10h摘眼球法取血,無菌取肝臟,生化及病理學檢查評估各組小鼠肝組織損傷程度. ELISA)去檢測小鼠血清RCOR3水平。 (2)時效關系研究 六周齡雄性Balb/c小鼠隨機分為正常對照組、大黃素組、模型組(ConA組)、治療組(12.5mg/kg+ConA組)。治療組按20mg/kg尾靜脈注射ConA,分別于ConA前2h以及ConA后5min、10min、30min、1h后給予大黃素12.5mg/kg灌胃,ConA組以CMC-Na(大黃素溶劑)代替大黃素,大黃素組以生理鹽水代替ConA,正常對照組不做處理。ConA10h摘眼球法取血,無菌取肝臟,生化及病理學檢查評估各組小鼠肝組織損傷程度。 (3)量效關系研究 六周齡雄性Balb/c小鼠隨機分為正常對照組、大黃素組、模型組(ConA組)、治療組(1.5625mg/kg+ConA組、3.125mg/kg+ConA組、6.25mg/kg+ConA組、12.5mg/kg+ConA組、25mg/kg+ConA組、50mg/kg+ConA組、1OOmg/kg+ConA組)。治療組按1.5625mg/kg、3.125mg/kg、6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg以及1OOmg/kg給予大黃素灌胃,2h后ConA尾靜脈注射,ConA組以CMC-Na(大黃素溶劑)代替大黃素,大黃素組以生理鹽水代替ConA,正常對照組不做處理。ConA10h摘眼球法取血,無菌取肝臟,生化及病理學檢查評估各組小鼠肝組織損傷程度。 (4)作用機制研究 取正常對照組、大黃素組、模型組(ConA組)、治療組(12.5mg/kg+ConA組)小鼠肝組織勻漿抽提RNA, Q-PCR檢測各組小鼠肝組織中MIP2及其受體CXCR2的核酸水平。 2.3統(tǒng)計學分析 用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0for Windows分析實驗數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(Mean±SE)表示,當數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊時,多組間兩兩比較采用單因素方差分析(ANOVA),當數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布或方差不齊時,多組間比較采用Kruskal Wallis檢驗,兩組間比較用Mann-Whitney U檢驗。相關性分析采用Spearman關聯(lián)分析。以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 3.研究結(jié)果 3.1慢性乙型肝炎患者與健康人血清中RCOR3的表達水平 相對于健康對照者(1.30±0.60),RCOR3蛋白在CHB輕度(1.82±0.24)、中度(1.72±0.85)以及重度患者(3.96±0.48)血清中的水平明顯升高(p0.01),而在SHB患者(0.92土0.09)的水平明顯降低,差異極其顯著(p0.01)。此外,RCOR3蛋白在CHB重度患者血清中的水平較輕中度患者明顯升高(p0.01),而SHB患者血清中RCOR3的水平較CHB輕中重度患者表達水平均顯著降低(p0.01)。相關性分析顯示,CHB患者血清RCOR3水平與血清TB水平呈正相關性(r=0.466.P0.01)。 3.2動物實驗研究RCOR3的作用機制 3.2.1ConA制備的爆發(fā)性肝炎小鼠肝組織中RCOR3動態(tài)變化情況 Q-PCR結(jié)果顯示,與正常對照組(1.01±0.09)相比,RCOR3在ConA1h (0.76±0.14)的表達降低不顯著,在ConA3h (1.15±0.14)(?)ConA6h(1.60±0.10)組的表達明顯升高,差異極其顯著(p0.01)。而3h組明顯高于1h組(p0.05),6h組明顯高于3h組(p0.05)。 3.2.2抗炎制劑(大黃素)對RCOR3的調(diào)控作用及其機制 (1)療效觀察 生化及病理學檢查均顯示大黃素以12.5mg/kg給藥具有保護小鼠肝臟的作用。模型組(1.66土0.52)小鼠血清中RCOR3蛋白水平明顯高于正常對照組(0.003±0.002),差異具有顯著性(p0.05)。而大黃素干預組(0.10±0.08)RCOR3蛋白水平明顯低于模型組(p0.05) (2)時效關系研究 ConA誘導前2h給予大黃素(12.5mg/kg+ConA組)灌胃,可以減輕ConA誘導的小鼠肝損傷程度。與ConA組(ALT：1647.0±163.24,AST：1139.0±102.79)相比較,大黃素干預組小鼠血清ALT(165.71±34.49)、 AST(290.0±76.28)水平顯著下降。病理切片亦顯示滿視野幾無壞死,炎細胞浸潤也減少。而ConA誘導后5min、10min、30min、1h給藥不具有保護肝臟的作用。 (3)量效關系研究 COnA誘導前2h給予給予大黃素100mg/kg(ALT:6496.0±1289.8,AST:4070.0±761.3)灌胃會加重小鼠肝損傷。而給予大黃素1.5625mg/kg(ALT:592.0±327.9, AST:596.0±207.2).3.125mg/kg(ALT:574.0±253.9, AST:596.0±169.8).6.25mg/kg(ALT:433.3±244.5,AST:466.7±188.7).12.5mg/kg(ALT:165.7±34.5,AST:290.0±76.28).25mg/kg(ALT:161.4±39.8,AST:248.6±28.9).50mg/kg(ALT:205.4±22.23,AST:289.2±30.31)灌胃其ALT、AST水平均較模型組明顯降低,而12.5mg/kg、25mg/kg.50mg/kg三組ALT.AST水平降低更明顯,但是組間無統(tǒng)計學差異。這三組小鼠肝組織病理切片亦顯示滿視野幾無壞死,炎細胞浸潤也減少。這表明大黃素以12.5mg／kg給藥即具有保護小鼠肝臟的作用。 (4)作用機制研究 Q-PCR實驗發(fā)現(xiàn),ConA組MIP2(494.7±125.0)及其受體CXCR2(21.5±5.4)顯著升高,大黃素可以顯著抑制MIP2(62.5±24.5)及其受體CXCR2(8.4±1.0)的水平。相關性分析顯示,小鼠血清RCOR3水平與MIP2及其受體CXCR2呈顯著正相關(1=0.746,P0.01；r=0.764,P0.01) 4.研究結(jié)論 (1)CHB輕度、中度和重度患者血清中RCOR3表達水平明顯高于健康人,而SHB患者明顯低于健康人和慢性乙型肝炎輕度、中度和重度患者,且CHB患者血清中RCOR3表達水平與血清TB水平呈顯著正相關。提示RCOR3參與了慢性乙型肝炎患者疾病的進展以及肝臟炎癥損傷的病理過程。 (2)大黃素通過MIP2／CXCR2途徑抑制RCOR3的表達,導致RCOR3對抗炎因子抑制作用的減弱,從而減輕了小鼠肝損傷程度。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575.1

【參考文獻】

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本文編號：2744525