【摘要】： 背景: 慢性乙型肝炎(CHB)威脅全人類健康,其中1/3以上的慢性感染者在中國(guó)�？共《局委熓锹砸倚透窝椎暮诵闹委煷胧�。核苷類似物是目前抗病毒治療的主流藥物之一。恩替卡韋(ETV)作為強(qiáng)效抑制乙型肝炎病毒(HBV)的核苷類藥物已逐漸在臨床上得到應(yīng)用。隨著應(yīng)用時(shí)間的推移和應(yīng)用群體的擴(kuò)大,ETV耐藥問題逐漸出現(xiàn)。目前有關(guān)ETV耐藥的研究國(guó)內(nèi)外僅見個(gè)案報(bào)道,所以對(duì)我國(guó)ETV治療失敗的患者進(jìn)行耐藥檢測(cè),對(duì)其基因變異特點(diǎn)與臨床特點(diǎn)進(jìn)行初步分析,可以為ETV耐藥后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用提供線索和依據(jù)。目前研究發(fā)現(xiàn),ETV的耐藥至少涉及逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT區(qū))3個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合變異,且變異類型多樣,還可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的變異,所以實(shí)時(shí)(Real-Time)熒光PCR、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)及基因芯片等檢測(cè)方法在建立上均比較困難,而PCR結(jié)合測(cè)序法則表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢(shì),具有更好的全面性。 目的: 1.建立一種可以較好擴(kuò)增HBV RT區(qū)的巢式PCR(ntPCR)方法,結(jié)合直接測(cè)序和克隆測(cè)序法檢測(cè)HBV耐藥變異。 2.對(duì)我國(guó)ETV治療失敗的患者進(jìn)行初步的耐藥基因變異特點(diǎn)與臨床資料分析,為ETV耐藥后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用提供線索和依據(jù)。 方法: 1.設(shè)計(jì)適于擴(kuò)增HBV RT區(qū)較長(zhǎng)基因片段的ntPCR引物并檢驗(yàn)其效能。建立ntPCR-測(cè)序法耐藥檢測(cè)平臺(tái),包括PCR產(chǎn)物直接測(cè)序和PCR克隆測(cè)序法。 2.篩集2008年1月~12月于北京地壇醫(yī)院就診的CHB患者中ETV治療失敗的患者血清20例。入選標(biāo)準(zhǔn):符合2000年《病毒性肝炎防治方案》CHB診斷標(biāo)準(zhǔn);患者規(guī)范服用ETV(劑量:核苷初治0.5mg/d,既往LVD治療失敗患者1.0mg/d)并且出現(xiàn)治療失敗,除外依從性等原因。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)20例標(biāo)本的耐藥情況,并分析其基因型。對(duì)其中的3例標(biāo)本進(jìn)行克隆測(cè)序,初步分析其耐藥基因特點(diǎn)。20例患者依據(jù)病毒學(xué)應(yīng)答情況,分為非完全病毒學(xué)應(yīng)答組(6例)和病毒學(xué)突破組(14例),對(duì)這兩組及不同基因型(B和C)的耐藥檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 1.瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序法證實(shí),ntPCR可擴(kuò)增幾乎整個(gè)HBV RT區(qū)(nt146- 1051)的位點(diǎn),即rt5～rt318,包含有目前已知的所有變異位點(diǎn),并且擴(kuò)增序列涵蓋了全長(zhǎng)HBsAg編碼區(qū),可同時(shí)用于對(duì)HBV S基因變異的檢測(cè),還可以用于基因分型。擴(kuò)增目的產(chǎn)物經(jīng)直接測(cè)序確證無誤。 2. ETV治療失敗患者耐藥檢測(cè)結(jié)果: 2.1 PCR直接測(cè)序法結(jié)果: ⑴20例患者中檢出ETV耐藥11例,其RT區(qū)變異類型以rtM204V+rtL180M +rtT184L變異最多(8/11),其次是rtM204V+rtL180M+rtS202G(3/11),未發(fā)現(xiàn)rt250位點(diǎn)的變異。 ⑵擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋HBV DNA全長(zhǎng)HBsAg編碼序列,對(duì)其進(jìn)行分析,20例患者中檢出sP127T 2例,sP127T為已發(fā)現(xiàn)的與HBsAg免疫逃逸有關(guān)的變異。 2.2對(duì)3例標(biāo)本(1號(hào)、5號(hào)和9號(hào))進(jìn)行了克隆測(cè)序。結(jié)果提示同一模板重復(fù)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)在一定程度上可彌補(bǔ)其敏感度低的缺陷。 2.3所有ETV耐藥患者均來自病毒學(xué)突破組,非完全病毒學(xué)應(yīng)答組患者中未檢出ETV耐藥,二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P =0.0022)。 2.4在11例ETV耐藥患者中有10例既往有LVD治療失敗史,其從應(yīng)用ETV到出現(xiàn)耐藥變異的平均治療時(shí)間為(19.43±2.72)月。 2.5在6例B基因型患者中檢出ETV耐藥3例(3/6),14例C基因型患者中檢出ETV耐藥8例(8/14),二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論 1.建立了一種較好擴(kuò)增HBV RT區(qū)較長(zhǎng)片段的方法,并涵蓋全長(zhǎng)HBsAg編碼區(qū)。該法結(jié)合測(cè)序法可以用于HBV P基因RT區(qū)及S基因變異的檢測(cè),還可以用于基因分型。 2.我國(guó)B和C基因型的乙肝患者中,ETV耐藥類型以rtM204V+rtL180M+rtT 184L多見。 3. ETV耐藥主要見于病毒學(xué)突破組,多見于既往LVD治療失敗患者。 4. ETV的耐藥檢出率在B和C基因型中無差別,結(jié)果可能受客觀標(biāo)本量影響,今后需進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

結(jié) 果CR 擴(kuò)增結(jié)果HBV B/C 基因型質(zhì)粒及從患者血清中提取的 HBV DNA 為模板，巢式V 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)，獲得預(yù)期約 906bp 的基因片段，條帶明亮單一，無非象（圖 1-1）。對(duì)不同 HBV DNA 滴度的血清標(biāo)本提取模板后進(jìn)行擴(kuò)如表 1-4，其中擴(kuò)增陰性的血清 HBV DNA 滴度均≤3×103。PCR 條模板中的 DNA 含量成正向關(guān)系。

表 1-4. 不同病毒滴度的乙肝患者血清標(biāo)本擴(kuò)增結(jié)果血清 HBV DNA 滴度 標(biāo)本例數(shù) PCR 擴(kuò)增陽性例數(shù) PCR 擴(kuò)增陽性率（%）1～9×10311 5 45.51～9×10420 20 1001×105及以上 29 29 1002. 測(cè)序結(jié)果分析測(cè)序結(jié)果運(yùn)用 CHROMAS 軟件讀取，以 YMDD 中 M 為標(biāo)志性位點(diǎn) rt204（圖1-2），分析 RT 區(qū)各常見變異位點(diǎn)的氨基酸替代情況。以 SDGN 中的 G 為 s145 分析 S 基因的變異情況。圖 1-1. 對(duì) B 和 C 基因型質(zhì)粒進(jìn)行 ntPCR 后 1.0%瓊脂糖凝膠鑒定(目的片段大小為 906bp)

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本文編號(hào)：2742831