【摘要】：第一部分肝再生增強(qiáng)因子對(duì)PBMC增殖的影響與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系’ 目的：肝再生增強(qiáng)因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)具有免疫調(diào)節(jié)作用,但其發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)控作用的機(jī)制尚未明確。本部分課題擬通過(guò)觀察人肝再生增強(qiáng)因子(Human augmenter of liver regeneration, hALR)在體外對(duì)ConA刺激的正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的增殖和凋亡的影響以及對(duì)其中CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell, Treg)亞群分化增殖的影響,探討hALR免疫抑制作用的可能機(jī)制。 方法：以ConA刺激的健康人PBMC為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,分別設(shè)Control組、ConA組和ConA+hALR組。體外培養(yǎng)60h后用MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率,流式及免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞的早期細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組FoxP3的表達(dá),流式檢測(cè)各組細(xì)胞CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例及細(xì)胞周期變化。 結(jié)果：hALR能夠明顯抑制ConA刺激的PBMC增殖(ConA組vs ConA+hALR組,P0.01),且hALR降低ConA引起的細(xì)胞凋亡(ConA組vs ConA+hALR組,P0.01)。hALR在抑制細(xì)胞增殖的同時(shí),上調(diào)FoxP3基因的表達(dá),提高Treg的比例(ConA組vs ConA+hALR組,P0.01),并且能夠解除ConA導(dǎo)致的Treg亞群細(xì)胞周期G2/M期阻滯(ConA組vs ConA+hALR組,P0.01)。 結(jié)論：hALR能夠顯著抑制ConA刺激的PBMC增殖,但不是通過(guò)誘導(dǎo)PBMC凋亡實(shí)現(xiàn)的,而是具有抗凋亡作用,hALR同時(shí)上調(diào)CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例,提示hALR可能通過(guò)誘導(dǎo)Treg來(lái)抑制ConA刺激的PBMC增殖。 第二部分肝再生增強(qiáng)因子誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制 目的：細(xì)胞因子在Treg的分化增殖及免疫抑制作用中發(fā)揮重要作用,本研究擬通過(guò)觀察hALR對(duì)各組細(xì)胞上清中細(xì)胞因子(TGF-β1、 IL-10、IL-2)水平的影響,以及對(duì)各組細(xì)胞信號(hào)通路分子(ERK1/2、 NF-κB)舌性及表達(dá)的影響,探討hALR促進(jìn)Treg分化增殖以及發(fā)揮免疫抑制作用的可能機(jī)制。 方法：以ConA刺激的健康人PBMC為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,分別設(shè)Control組、ConA組和ConA+hALR組。用ELISA方法分別檢測(cè)培養(yǎng)16h和40h各組細(xì)胞上清中TGF-β1、IL-10、IL-2的水平,用免疫印跡法檢測(cè)培養(yǎng)60h的各組細(xì)胞ERK1/2的活性和NF-κB (p65)的表達(dá)。 結(jié)果：hALR能夠顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1和IL-10的水平,降低IL-2的水平(ConA組vs ConA+hALR組,P0.01)。hALR能夠顯著抑制ERK1/2的活性和NF-κB (p65)的表達(dá)(ConA組vsConA+hALR組,P0.01)。 結(jié)論：hALR可以促進(jìn)TGF-β1和IL-10產(chǎn)生而抑制IL-2產(chǎn)生,能夠抑制ERK1/2的活性和NF-κB (p65)的表達(dá),提示hALR對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)控可能既是hALR上調(diào)Treg的條件也是其發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制,在分子機(jī)制上則表現(xiàn)為對(duì)信號(hào)通路分子的調(diào)控。 第三部分肝再生增強(qiáng)因子對(duì)大鼠腹腔肝細(xì)胞移植免疫排斥的影響 目的：hALR體外能夠上調(diào)Treg并抑制ConA活化的免疫細(xì)胞增殖,本部分研究擬通過(guò)觀察腹腔內(nèi)同種異體肝細(xì)胞移植(Hepatocyte transplantation, HCT)聯(lián)合hALR治療急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)大鼠的療效,以及hALR對(duì)大鼠免疫排斥反應(yīng)的影響,探討hALR體內(nèi)的免疫抑制作用及機(jī)制。 方法：以D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)誘導(dǎo)ALF的S-D大鼠為動(dòng)物模型,半原位膠原酶灌注法新鮮分離的大鼠肝細(xì)胞腹腔內(nèi)移植聯(lián)合hALR治療ALF大鼠,分為生理鹽水(PS)組、HCT組、HCT+hALR組、hALR組。觀察各組大鼠生存率,組織學(xué)分析腹腔內(nèi)移植肝細(xì)胞存活情況,免疫組化檢測(cè)大網(wǎng)膜免疫細(xì)胞CD68、CD4、CD8及Foxp3陽(yáng)性率,流式檢測(cè)腹腔內(nèi)大網(wǎng)膜免疫細(xì)胞中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)移植物周圍大網(wǎng)膜免疫細(xì)胞TGF-β1、IL-10mRNA表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)腹水及血清中TNF-a和IL-1β水平。 結(jié)果：hALR聯(lián)合HCT治療能夠顯著提高大鼠生存率(P0.05),且hALR明顯改善腹腔移植物存活情況,減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。hALR明顯降低大網(wǎng)膜免疫細(xì)胞CD68、CD4、CD8陽(yáng)性率,增加Foxp3陽(yáng)性率,上調(diào)大網(wǎng)膜免疫細(xì)胞中Treg的比例和TGF-β1、IL-10mRNA的表達(dá),降低前炎癥介質(zhì)TNF-a和IL-1β水平(HCT組vs HCT+hALR組,P0.05)。 結(jié)論：hALR能夠通過(guò)上調(diào)腹腔HCT的ALF大鼠腹腔大網(wǎng)膜內(nèi)Treg的比例,抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)和對(duì)腹腔移植物的免疫排斥反應(yīng),改善腹腔移植物存活,最終提高ALF大鼠存活率。這提示hALR在ALF大鼠體內(nèi)同樣具有免疫抑制作用,能夠抑制機(jī)體對(duì)移植物的免疫排斥反應(yīng),促進(jìn)移植耐受,而上調(diào)Treg可能是hALR發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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2 孫航,余慧峰,吳傳新,管小琴,劉杞;肝再生增強(qiáng)因子在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J];中華肝臟病雜志;2005年03期

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本文編號(hào)：2742748