發(fā)布時間：2020-07-05 12:34

【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染發(fā)病率高,嚴重危害人們的生命健康。全世界乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性者約3.5億,我國約有1.2億,其中3000萬為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者。據統(tǒng)計,全球每年約有80萬人死于HBV慢性感染所引發(fā)的重型肝炎、肝硬化和肝細胞癌等相關疾病。因此防治HBV感染對提高人們的健康水平具有重要意義。 抗病毒治療是臨床上治療慢性乙型肝炎的主要措施。核苷/酸類藥物因其用藥方便、副作用少、能迅速抑制HBV復制等優(yōu)點得到廣泛應用。臨床上應用的此類藥物主要有拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)等,但隨著用藥時間的延長,出現(xiàn)HBV耐藥相關性變異的機率越來越高,并隨之出現(xiàn)HBV-DNA反跳、肝功能惡化,因此耐藥已成為抗HBV治療中迫切需要解決的問題。實驗研究發(fā)現(xiàn),HBV在人體免疫壓力和藥物作用下易發(fā)生變異,加之HBV逆轉錄酶(reverse transcriptase,RT)區(qū)不具備校正功能,更加劇了HBV的突變,使病毒持續(xù)存在和不斷復制,導致病情進展。近年來,國內外學者進行了大量探索,盡管建立了多種檢測HBV耐藥相關性基因變異的方法,但各有其特點和局限性,因此建立一種具有較高特異性和靈敏性且操作簡便的方法對于國內臨床抗HBV治療具有重要的現(xiàn)實意義。 本研究旨在建立和優(yōu)化擴增慢性乙型肝炎患者血清標本中HBV P基因的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)方法,比較DNA序列測定與線性反向探針雜交法(INNO-LiPA試劑)檢測HBV基因突變的結果,以期為指導臨床制定合理的個體化治療方案提供重要手段。 93例研究對象均系慢性乙型肝炎患者,男77例,女16例,年齡16～66歲;HBsAg陽性均超過6個月;既往接受核苷/酸類藥物治療至少6個月。所有患者治療期間均出現(xiàn)可疑耐藥的情況,或者血清HBV-DNA不同程度下降后又出現(xiàn)反彈,或者HBV DNA自最低值上升1log10 copies /mL,并伴或不伴有ALT升高。以上研究均獲得患者的知情同意。 研究的內容和實驗結果如下: 1. HBV血生化指標 抽取使用核苷/酸類藥物不同階段慢性乙型肝炎患者的外周血,常規(guī)檢測HBV-DNA、ALT和TBiL等血生化指標。發(fā)現(xiàn)不同時間點患者的HBV-DNA和ALT與治療前相比均明顯降低(P0.05),但是LAM組和聯(lián)合用藥組的HBV-DNA在治療13～24月階段比7～12月階段明顯升高(P0.05)。TBiL變化無統(tǒng)計學意義。 2.擴增HBV-DNA P基因逆轉錄酶片段巢式PCR方法的建立根據GenBank收錄的HBV adr亞型基因全序列(GI:329616)。采用Oligo6.67軟件輔助分析,設計巢式PCR引物,通過反復試驗,篩選出有較好序列兼容性及較高反應效率的外引物和內引物,目的片段大小為725bp,包括RT區(qū)A、B、C、D、E亞區(qū)。用不同病毒載量的患者血清提取出的HBV-DNA作為模板,反復試驗,優(yōu)化巢式PCR反應條件,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 3. DNA序列測定 取PCR產物進行序列測定(由上海Invitrogen生物技術有限公司完成),成功測序86份,其中含2例血清標本中的HBV-DNA1×103copies/mL者。進一步用SeqmanTMⅡ、EditSeq TM和MegAlign軟件進行分析,共檢測到突變位點113個。除已知確定的相關耐藥位點外,還檢測到V84I、S85C、A181S、L229W、N238H、N238A和N238T等突變位點。 4.線性探針反向雜交法的檢測 隨機抽取40例患者的血清標本,用線性反向探針雜交法(INNO-LiPA HBV DR v3)檢測已知的11個耐藥位點,即HBV-DNA聚合酶的第80、173、180、181、184、194、202、204、233、236和250位氨基酸。經擴增、雜交、洗脫、顯色后在檢測條帶上呈紫/棕色沉淀物。在40份血清標本中檢出了以下突變形式:10例L180M+M204V,1例V173L+L180M+M204V,7例M204I,另有L80I+M204I、L80I、L80V、A181T、A181V和N236T各1例。僅5例與DNA測序結果不一致。 結論: 1.核苷/酸類藥物長期使用可導致耐藥,多出現(xiàn)在治療12個月以后。 2.建立在巢式PCR基礎上的DNA序列測定法,其敏感性與INNO-LiPA相當,檢測結果與INNO-LiPA試劑有較高符合率,并可檢出更多的耐藥相關突變,提供更全面的信息,且價格相對便宜,更加適合現(xiàn)實的中國國情。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62
【圖文】：

LdT結構與LAM相似，其耐藥變異位點主要是rtM204I[18]。圖1 常用NA耐藥相關變異位點示意圖3.2.2 不同核苷/酸類似物的耐藥變異發(fā)生率CHB患者在接受核苷類藥物治療中發(fā)生病毒耐藥變異與治療前病毒載量、藥物抑制病毒復制能力、用藥時間長短等密切相關。LAM治療1年的患者rtM204V/I變異率為16～30％，而治療4～5年變異發(fā)生率可高達70％[29]。Yuen等[30]報道治療24周時血清HBV-DNA下降至2×102copies/mL以下的，耐藥變異發(fā)生率僅8%；而HBV-DNA水平為2×102～103copies/mL 時，耐藥變異發(fā)生率為 13% ； HBV-DNA 水平為 1×103 ～1×104copies/mL 時。耐藥變異發(fā)生率上升為 32% ； HBV-DNA 水平大于1×104copies/mL時，耐藥變異率高達64%。因此可見，治療24周時，病毒耐藥變異發(fā)生率與血清HBV-DNA水平成正相關，即病毒耐藥變異發(fā)生率與藥物對HBV復制的抑制強度成負相關。Liaw等[31]報道

第四軍醫(yī)大學碩士學位論文3.2 2%AGE 結果從 不 同 病 毒 載 量 （ 最 高 為 4.4 × 108copies/mL, 最 低 為 ＜ 1 ×103copies/mL）的患者血清中提取 HBV-DNA，經巢式 PCR 成功擴增出 725bp的 HBV P 基因片段，經 2%瓊脂糖凝膠電泳證實，片段大小相符（圖 1）

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 徐東平;李進;張玲霞;;恩替卡韋治療慢性乙型肝炎的研究進展[J];中華醫(yī)學雜志;2006年28期

本文編號：2742609