【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染發(fā)病率高,嚴(yán)重危害人們的生命健康。全世界乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性者約3.5億,我國約有1.2億,其中3000萬為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年約有80萬人死于HBV慢性感染所引發(fā)的重型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等相關(guān)疾病。因此防治HBV感染對(duì)提高人們的健康水平具有重要意義。 抗病毒治療是臨床上治療慢性乙型肝炎的主要措施。核苷/酸類藥物因其用藥方便、副作用少、能迅速抑制HBV復(fù)制等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。臨床上應(yīng)用的此類藥物主要有拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)等,但隨著用藥時(shí)間的延長,出現(xiàn)HBV耐藥相關(guān)性變異的機(jī)率越來越高,并隨之出現(xiàn)HBV-DNA反跳、肝功能惡化,因此耐藥已成為抗HBV治療中迫切需要解決的問題。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),HBV在人體免疫壓力和藥物作用下易發(fā)生變異,加之HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,RT)區(qū)不具備校正功能,更加劇了HBV的突變,使病毒持續(xù)存在和不斷復(fù)制,導(dǎo)致病情進(jìn)展。近年來,國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量探索,盡管建立了多種檢測(cè)HBV耐藥相關(guān)性基因變異的方法,但各有其特點(diǎn)和局限性,因此建立一種具有較高特異性和靈敏性且操作簡便的方法對(duì)于國內(nèi)臨床抗HBV治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本研究旨在建立和優(yōu)化擴(kuò)增慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本中HBV P基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法,比較DNA序列測(cè)定與線性反向探針雜交法(INNO-LiPA試劑)檢測(cè)HBV基因突變的結(jié)果,以期為指導(dǎo)臨床制定合理的個(gè)體化治療方案提供重要手段。 93例研究對(duì)象均系慢性乙型肝炎患者,男77例,女16例,年齡16～66歲;HBsAg陽性均超過6個(gè)月;既往接受核苷/酸類藥物治療至少6個(gè)月。所有患者治療期間均出現(xiàn)可疑耐藥的情況,或者血清HBV-DNA不同程度下降后又出現(xiàn)反彈,或者HBV DNA自最低值上升1log10 copies /mL,并伴或不伴有ALT升高。以上研究均獲得患者的知情同意。 研究的內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 1. HBV血生化指標(biāo) 抽取使用核苷/酸類藥物不同階段慢性乙型肝炎患者的外周血,常規(guī)檢測(cè)HBV-DNA、ALT和TBiL等血生化指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)患者的HBV-DNA和ALT與治療前相比均明顯降低(P0.05),但是LAM組和聯(lián)合用藥組的HBV-DNA在治療13～24月階段比7～12月階段明顯升高(P0.05)。TBiL變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.擴(kuò)增HBV-DNA P基因逆轉(zhuǎn)錄酶片段巢式PCR方法的建立根據(jù)GenBank收錄的HBV adr亞型基因全序列(GI:329616)。采用Oligo6.67軟件輔助分析,設(shè)計(jì)巢式PCR引物,通過反復(fù)試驗(yàn),篩選出有較好序列兼容性及較高反應(yīng)效率的外引物和內(nèi)引物,目的片段大小為725bp,包括RT區(qū)A、B、C、D、E亞區(qū)。用不同病毒載量的患者血清提取出的HBV-DNA作為模板,反復(fù)試驗(yàn),優(yōu)化巢式PCR反應(yīng)條件,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 3. DNA序列測(cè)定 取PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定(由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司完成),成功測(cè)序86份,其中含2例血清標(biāo)本中的HBV-DNA1×103copies/mL者。進(jìn)一步用SeqmanTMⅡ、EditSeq TM和MegAlign軟件進(jìn)行分析,共檢測(cè)到突變位點(diǎn)113個(gè)。除已知確定的相關(guān)耐藥位點(diǎn)外,還檢測(cè)到V84I、S85C、A181S、L229W、N238H、N238A和N238T等突變位點(diǎn)。 4.線性探針反向雜交法的檢測(cè) 隨機(jī)抽取40例患者的血清標(biāo)本,用線性反向探針雜交法(INNO-LiPA HBV DR v3)檢測(cè)已知的11個(gè)耐藥位點(diǎn),即HBV-DNA聚合酶的第80、173、180、181、184、194、202、204、233、236和250位氨基酸。經(jīng)擴(kuò)增、雜交、洗脫、顯色后在檢測(cè)條帶上呈紫/棕色沉淀物。在40份血清標(biāo)本中檢出了以下突變形式:10例L180M+M204V,1例V173L+L180M+M204V,7例M204I,另有L80I+M204I、L80I、L80V、A181T、A181V和N236T各1例。僅5例與DNA測(cè)序結(jié)果不一致。 結(jié)論: 1.核苷/酸類藥物長期使用可導(dǎo)致耐藥,多出現(xiàn)在治療12個(gè)月以后。 2.建立在巢式PCR基礎(chǔ)上的DNA序列測(cè)定法,其敏感性與INNO-LiPA相當(dāng),檢測(cè)結(jié)果與INNO-LiPA試劑有較高符合率,并可檢出更多的耐藥相關(guān)突變,提供更全面的信息,且價(jià)格相對(duì)便宜,更加適合現(xiàn)實(shí)的中國國情。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

LdT結(jié)構(gòu)與LAM相似，其耐藥變異位點(diǎn)主要是rtM204I[18]。圖1 常用NA耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)示意圖3.2.2 不同核苷/酸類似物的耐藥變異發(fā)生率CHB患者在接受核苷類藥物治療中發(fā)生病毒耐藥變異與治療前病毒載量、藥物抑制病毒復(fù)制能力、用藥時(shí)間長短等密切相關(guān)。LAM治療1年的患者rtM204V/I變異率為16～30％，而治療4～5年變異發(fā)生率可高達(dá)70％[29]。Yuen等[30]報(bào)道治療24周時(shí)血清HBV-DNA下降至2×102copies/mL以下的，耐藥變異發(fā)生率僅8%；而HBV-DNA水平為2×102～103copies/mL 時(shí)，耐藥變異發(fā)生率為 13% ； HBV-DNA 水平為 1×103 ～1×104copies/mL 時(shí)。耐藥變異發(fā)生率上升為 32% ； HBV-DNA 水平大于1×104copies/mL時(shí)，耐藥變異率高達(dá)64%。因此可見，治療24周時(shí)，病毒耐藥變異發(fā)生率與血清HBV-DNA水平成正相關(guān)，即病毒耐藥變異發(fā)生率與藥物對(duì)HBV復(fù)制的抑制強(qiáng)度成負(fù)相關(guān)。Liaw等[31]報(bào)道

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 2%AGE 結(jié)果從 不 同 病 毒 載 量 （ 最 高 為 4.4 × 108copies/mL, 最 低 為 ＜ 1 ×103copies/mL）的患者血清中提取 HBV-DNA，經(jīng)巢式 PCR 成功擴(kuò)增出 725bp的 HBV P 基因片段，經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)，片段大小相符（圖 1）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐東平;李進(jìn);張玲霞;;恩替卡韋治療慢性乙型肝炎的研究進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2006年28期

本文編號(hào)：2742609