【摘要】：乙型肝炎病毒(HBV)感染是危害人類健康和生命的重要因素之一,尤其是在東亞和非洲南部,其中我國是乙肝感染最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。乙肝病毒感染可引起體內(nèi)眾多基因表達(dá)發(fā)生變化,逐步造成慢性肝炎,肝硬化直至發(fā)展成為肝細(xì)胞癌(HCC)。肝細(xì)胞癌在世界范圍內(nèi)最常見癌癥中排名第六位,并且其致死率為第三位。膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1(CTHRC1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型基因編碼的蛋白,目前闡明的功能主要為抑制膠原蛋白的沉積,促進(jìn)細(xì)胞遷移,以及加速血管修復(fù)等。迄今為止,據(jù)報(bào)道在很多實(shí)體腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了CTHRC1基因的異常高表達(dá),如胃腸癌,肺癌,乳腺癌,甲狀腺癌,卵巢癌,子宮頸癌和胰腺癌等。但是CTHRC1在HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況并不清楚。 臨床數(shù)據(jù)顯示HBV感染導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌的癌組織中的CTHRC1的mRNA和蛋白水平明顯高于癌旁組織。我們推測(cè)CTHRC1可能在HBV相關(guān)的HCC發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。為了證實(shí)我們的想法,我們選取了16例正常肝組織,24例慢性肝炎組織,32例肝硬化組織和32例肝細(xì)胞癌組織進(jìn)行了免疫組化分析,隨著病變程度的加深,CTHRC1檢測(cè)陽性率逐漸增高。在各個(gè)階段的病變組織中,HBV感染相對(duì)于其他致病因子更顯著的促進(jìn)了CTHRC1的表達(dá)。同時(shí)我們檢測(cè)的HBV感染患者血清中的CTHRC1表達(dá)量明顯高于正常健康者血清中的表達(dá)量。這些臨床數(shù)據(jù)表明HBV感染可以極大程度上促進(jìn)CTHRC1的表達(dá)。 接下來我們分析了CTHRC1在不同肝細(xì)胞系中的表達(dá)情況,正常肝細(xì)胞L02,肝癌細(xì)胞系HepG2和持續(xù)表達(dá)HBV蛋白的HepG2.2.15中的CTHRC1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平依次增高；將HBV瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后也可以誘導(dǎo)CTHRC1表達(dá),并且HBV對(duì)CTHRC1的誘導(dǎo)呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量上的依賴效應(yīng)。為了進(jìn)一步確認(rèn)HBV誘導(dǎo)CTHRC1表達(dá)的機(jī)制,我們構(gòu)建了CTHRC1的全長啟動(dòng)子,并用軟件預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子上的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn),依次進(jìn)行了一系列截?cái)嗪歪槍?duì)各自位點(diǎn)的突變。與HBV全長質(zhì)粒共轉(zhuǎn),通過檢測(cè)啟動(dòng)子活性,我們發(fā)現(xiàn)HBV主要通過NF-κB和CRE兩條信號(hào)通路激活CTHRC1啟動(dòng)子活性來誘導(dǎo)CTHRC1表達(dá),并分別由CHIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了此結(jié)論。 為了進(jìn)一步探討CTHRC1在HBV相關(guān)的HCC中發(fā)揮重要作用的機(jī)制,我們檢測(cè)了CTHRC1對(duì)HIF-1α和VEGF基因表達(dá)的影響。CTHRC1濃度增加刺激HI-1α和VEGF基因的表達(dá)。初步分析其中的機(jī)制,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子ERK1/2和Akt磷酸化水平增加,經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路ERK1/2和PI3K的激活是CTHRC1誘導(dǎo)HIF-1α和VEGF基因的表達(dá)的主要原因。CTHRC1因此可能在啟動(dòng)腫瘤血管生成方面發(fā)揮重要作用。在腫瘤細(xì)胞增殖,遷移和侵襲方面,CTHRC1表達(dá)抑制p53基因,促進(jìn)細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)MMP9基因表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。這些過程在HBV誘發(fā)的HCC發(fā)展中至關(guān)重要。 最后我們利用動(dòng)物模型直觀地展示了CTHRC1促進(jìn)腫瘤生成的潛力。我們將HepG2.2.15細(xì)胞植入裸鼠皮下,利用重組腺病毒CTHRC1-RNAi-AD抑制CTHRC1基因表達(dá),結(jié)果顯示,對(duì)比于感染無義RNAi和空白細(xì)胞組裸鼠皮下的腫瘤,CTHRC1-RNAi-AD感染組的腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間推遲,增長的速率減緩。最終生成腫瘤的體積和重量都小于無義RNAi對(duì)照組和空白細(xì)胞組,具有顯著性差異,P0.05。 綜合研究結(jié)果,我們確認(rèn)CTHRC1是HBV相關(guān)HCC進(jìn)程中一個(gè)至關(guān)重要的調(diào)控因子,這些結(jié)果為探究HBV誘發(fā)HCC發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制打下了基礎(chǔ),為治療HCC提供了新的靶標(biāo)和新的可行性。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R735.7;R512.62
【圖文】：

乙型肝炎病毒形態(tài)圖(Wei，Neuveutetal.2010)

圖 1.2 HBV 的基因組圖譜(Wei，Neuveut et al. 2010)HBV的基因組是松她的雙鏈環(huán)狀DNA。兩條DNA鏈的長度不同。長鏈大3.2kb，為負(fù)編碼鏈，而正鏈長度卻不盡相同，從長鏈的50%至100%不等。鏈的5’端互補(bǔ)形成粘性末端從而形成環(huán)狀。5’端含有2個(gè)llbp的重復(fù)，2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2739601