【摘要】：研究目的 以油酸誘導正常人肝臟細胞L-02細胞建立NAFLD細胞模型，研究NAFLD形成前后核轉錄共激活因子PGC-1α表達、脂質及氧化應激水平的變化，在模型建立成功的基礎上添加胰島素增敏劑二甲雙胍，觀察不同濃度二甲雙胍對NAFLD細胞模型PGC-1α基因及蛋白質的表達、氧化應激水平的影響，以及PGC-1α的表達與肝臟細胞脂肪堆積、線粒體損傷及氧化應激的關系，探討PGC-1α在NAFLD發(fā)病過程中的作用，從而進一步闡明NAFLD的發(fā)病機制及二甲雙胍用于NAFLD治療的作用機制。 研究方法 用20μg/ml油酸(油酸以0.5%DMSO溶解)誘導正常人肝臟細胞L-02細胞72h，建立非酒精性脂肪變性肝細胞模型。通過電鏡觀察及細胞內甘油三酯水平的檢測鑒定模型建立成功。對照組加入含10%胎牛血清的普通1640培養(yǎng)基。在模型組中分別添加含2.5、5、7.5mmol/l終濃度的二甲雙胍分別建立低、中、高劑量組，標記為1、2、3組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細胞。采用RT-PCR檢測L-02細胞PGC-1α mRNA的轉錄，Western blot技術檢測L-02細胞PGC-1α蛋白質的表達，采用甘油三酯（組織細胞）酶法測定試劑盒檢測L-02細胞中甘油三脂的變化，采用硫代巴比妥酸反應法測定細胞MDA含量，采用黃嘌呤氧化物法測定細胞SOD活性。 結果 1.電鏡下觀察 對照組細胞中可見少量大小不等的脂滴，線粒體呈橢圓形或圓形，嵴膜清晰。模型組細胞中脂滴明顯增多（生化檢測示模型組細胞內甘油三酯水平明顯升高，說明油酸誘導造模成功），少數(shù)線粒體出現(xiàn)空泡樣改變。二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l（1組）、5mmol/l（2組）組細胞中可見脂滴分布，線粒體空泡樣改變有所減少。二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l（3組）組細胞中可見較少脂滴，線粒體稍腫脹，但線粒體嵴膜清晰。 2.細胞內甘油三酯水平 與對照組相比，模型組細胞內甘油三酯水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；當二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l時，細胞內甘油三脂明顯減少，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l組比終濃度為2.5mmol/l組細胞內甘油三脂明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）； 3.細胞內MDA濃度和SOD活力 與對照組相比，模型組細胞內MDA濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），而SOD活力卻明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；與模型組相比，當二甲雙胍終濃度為5mmol/l組、7.5mmol/l時，細胞內MDA濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），而SOD活力卻升高，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；與二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l組相比，當二甲雙胍終濃度為5mmol/l、7.5mmol/l時，細胞內MDA濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），而SOD活力卻升高，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 4.細胞PGC-1α mRNA轉錄水平 與對照組相比，模型組L-02細胞中PGC-1α mRNA表達量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與模型組相比，當二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l、5mmol/l、7.5mmol/l時L-02細胞中PGC-1α mRNA表達量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l組比終濃度為2.5mmol/l組細胞內PGC-1αmRNA表達量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.細胞PGC-1α蛋白質表達水平 與對照組相比，模型組L-02細胞中PGC-1α蛋白質表達量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與模型組相比，當二甲雙胍終濃度為5mmol/l、7.5mmol/l時L-02細胞中PGC-1α蛋白質表達水平明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6.相關性 肝細胞中PGC-1α表達水平與甘油三酯、MDA及SOD的相關性：L-02細胞中PGC-1α mRNA、蛋白質的表達水平與細胞內甘油三酯的水平呈負相關(r=-0.581、-0.601，P0.05)；PGC-1α mRNA、蛋白質的表達水平與細胞內MDA的水平呈負相關(r=-0.629、-0.571，P0.05)；PGC-1α mRNA、蛋白質的表達水平與細胞內SOD的水平呈相關(r=0.746、0.574，P0.05)。 結論 1、用20μg/ml油酸誘導L-02細胞可成功構建NAFLD細胞模型。 2、PGC-1α表達水平降低可能在NAFLD的發(fā)病過程中起著重要的作用。 3、二甲雙胍可改善NAFLD細胞模型內的氧化應激水平。 4、二甲雙胍通過調節(jié)細胞內PGC-1α的表達及氧化應激水平從而減少脂肪堆積可能是用于非酒精性脂肪肝治療的分子機制之一。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5

【參考文獻】

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本文編號：2739578