【摘要】：暴發(fā)性病毒肝炎（Fulminant viral hepatitis，F(xiàn)H)是病毒感染引起的大規(guī)模肝細(xì)胞壞死，嚴(yán)重的肝功能損害、肝性腦病等為特征的臨床綜合癥。常見于中國及其他HBV流行的亞洲國家，起病急，死亡率高，缺乏有效的治療手段。尋找有效的治療手段需要我們對其致病機(jī)制有更進(jìn)一步的認(rèn)識，對MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎模型的研究將有利于我們更進(jìn)一步的認(rèn)識暴發(fā)性肝炎的發(fā)病機(jī)制，為暴發(fā)性肝炎的臨床治療提供新的理論依據(jù)。 MHV-3是冠狀病毒科的單正鏈RNA病毒，敏感小鼠如Balb/c、C57/BL感染可在肝血竇形成血栓，致肝臟微循環(huán)改變，大量肝細(xì)胞缺血壞死，引起暴發(fā)性病毒肝炎且3-7天死亡，而A/J等耐受小鼠則對其完全耐受，不表現(xiàn)出任何臨床癥狀。敏感小鼠感染MHV-3后，單核巨噬細(xì)胞活化表達(dá)凝血酶原酶纖維介素（Fibrinogen like protein2/fibroleukin, FGL2），裂解凝血酶原為有活性的凝血酶，啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)，引起纖維蛋白沉積，血管內(nèi)凝血，肝血竇血栓形成，肝細(xì)胞壞死。 B、T淋巴細(xì)胞衰減子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）是新近鑒定的具有抑制T細(xì)胞活化增殖的CD28免疫球蛋白超家族成員。BTLA與其配體皰疹病毒侵入受體（herpes virus entry mediator，HVEM）結(jié)合后可以抑制CMV特異的CD8+T細(xì)胞的活化增殖以及IL-2的分泌，在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)節(jié)以及外周免疫耐受中發(fā)揮重要的作用。BTLA參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如BTLA-/-小鼠對實驗性自身免疫性腦炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)，過敏性呼吸道炎癥以及自身免疫性肝炎等較WT小鼠更為敏感。BTLA在感染疾病中同樣發(fā)揮了重要作用，CMV感染中，BTLA在CMV特異的CD8+T細(xì)胞上高表達(dá)，阻斷BTLA信號，可增強(qiáng)CMV特異的CD8+T細(xì)胞的增殖，說明BTLA可抑制病毒特異性的CTL反應(yīng)。對寄生蟲感染的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷BTLA信號，可以加快機(jī)體對李斯特桿菌的清除。在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn)，PD-1可以減輕MHV-3誘導(dǎo)的肝損傷。與WT小鼠相比，PD-1-/-小鼠MHV-3感染后肝臟病變更嚴(yán)重，死亡率更高，提示CD28家族成員參與了MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎。目前為止，BTLA在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎還未知。 為明確BTLA在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)肝炎中的作用，我們以BTLA-/-和WT小鼠為研究對象，腹腔感染MHV-3后，比較兩組小鼠的生存曲線，肝臟病理，血清ALT、AST、FGL2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT小鼠在感染后9天內(nèi)全部死亡，而BTLA-/-小鼠在感染后20天仍有87.5%(7/8)的存活。HE染色發(fā)現(xiàn)感染后48hWT小鼠即有嚴(yán)重的肝細(xì)胞、脾細(xì)胞壞死，到72h更劇，而同時相的BTLA-/-小鼠肝臟、脾臟細(xì)胞均較正常。與HE結(jié)果一致，TUNEL分析可見WT小鼠大量肝細(xì)胞、脾細(xì)胞凋亡，而BTLA-/-凋亡較少。BTLA-/-小鼠血清ALT、AST顯著性低于感染后同時相WT小鼠。免疫雙熒光分析發(fā)現(xiàn)FGL2表達(dá)于CK18+的上皮細(xì)胞，F(xiàn)4/80+的巨噬細(xì)胞，CD11C+的DC細(xì)胞和CD31+的內(nèi)皮細(xì)胞，少量表達(dá)于CD3+T細(xì)胞。BTLA-/-小鼠感染MHV-3后，血清FGL2顯著性低于WT小鼠；肝臟fgl2mRNA水平明顯低于WT小鼠；與mRNA一致，肝臟FGL2也明顯較WT少，纖維蛋白沉積也較少。本部分實驗結(jié)果提示，BTLA不是減弱，而是促進(jìn)了MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎。BTLA基因敲除后可使小鼠FGL2表達(dá)顯著性降低，纖維素沉積減少，肝臟病理減輕，使MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎致死率降低。 為進(jìn)一步明確BTLA促進(jìn)MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎的作用機(jī)制，首先免疫熒光分析BTLA在器官中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在肝臟、脾臟、淋巴結(jié)均有BTLA陽性細(xì)胞。流式分析發(fā)現(xiàn)MHV-3感染后，BTLA在CD4+T、CD8+T、B細(xì)胞上表達(dá)下調(diào)，而在巨噬細(xì)胞上顯著性上調(diào)。BTLA-/-和WT小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)相當(dāng)量的共刺激分子，凋亡相關(guān)分子以及促炎細(xì)胞因子。MHV-3感染后，Annex-V/PI染色發(fā)現(xiàn)，BTLA-/-小鼠巨噬細(xì)胞的凋亡顯著性高于WT小鼠，進(jìn)而BTLA-/-小鼠MHV-3感染24h，腹腔巨噬細(xì)胞，肝臟巨噬細(xì)胞頻率明顯低于WT小鼠；巨噬細(xì)胞體外感染MHV-3，TUNEL分析其凋亡也發(fā)現(xiàn)BTLA-/-小鼠巨噬細(xì)胞凋亡明顯高于WT巨噬細(xì)胞。本部分實驗結(jié)果提示，巨噬細(xì)胞上BTLA的表達(dá)維持了其存活，BTLA基因敲除后，MHV-3感染可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的凋亡增加，炎癥反應(yīng)減輕，F(xiàn)GL2分泌減少，進(jìn)而保護(hù)小鼠的肝臟免受損傷，提高了其生存率。 為明確巨噬細(xì)胞凋亡是否會導(dǎo)致炎癥因子的減少。我們以RT-PCR方法分析BTLA-/-和WT小鼠MHV-3感染后肝臟炎癥因子的mRNA，發(fā)現(xiàn)肝臟中TNF-α mRNA顯著性低于WT小鼠，而其他細(xì)胞因子，如IL-2、IL-4等變化不明顯。流式分析巨噬細(xì)胞單個水平TNF-α分泌情況，結(jié)果顯示BTLA-/-小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α分泌顯著性高于WT小鼠，但由于BTLA-/-小鼠巨噬細(xì)胞凋亡顯著性高于WT小鼠，因此BTLA-/-小鼠血清TNF-α水平卻顯著性低于WT小鼠。MHV-3感染后，給BTLA-/-小鼠體內(nèi)補充TNF-α重組蛋白，可使肝臟病變加重，血清ALT、AST、FGL2顯著增高，死亡率增高。TNF-α-/-小鼠感染MHV-3后，其死亡率、肝臟病變以及血清ALT、AST、FGL2等顯著性低于其野生型。這些結(jié)果表明，TNF-α在BTLA促進(jìn)MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎中發(fā)揮了非常重要的作用，BTLA基因敲除后，MHV-3感染所致的巨噬細(xì)胞大量凋亡，導(dǎo)致體內(nèi)TNF-α顯著性降低，F(xiàn)GL2分泌減少，肝臟病變減輕，死亡率減少。 為進(jìn)一步明確巨噬細(xì)胞上BTLA分子的缺失是導(dǎo)致BTLA-/-小鼠對MHV-3耐受的主要原因，我們分選WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，過繼回輸給感染了MHV-3的BTLA-/-小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡率明顯增高。WT小鼠感染MHV-3后，體內(nèi)阻斷BTLA信號，可使小鼠的存活時間明顯延長，死亡率明顯減少。 綜上，在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎中，BTLA通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的存活，進(jìn)而影響了肝臟病變的嚴(yán)重程度，小鼠的致死率。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575.1
【圖文】：

圖1-1：H&E分析肝臟病理，免疫組化分析肝組織中FGL2表達(dá)及纖維蛋白沉積情況。HBV-ACLF患者肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重，大量CD68+細(xì)胞浸潤，F(xiàn)GL2表達(dá)及纖維蛋白沉積。Fig1-1：The morphology of liver biopsy from FH patients with HBV-ACLP, mild CHB and normalhealth was compared by H&E staining, and the expression of CD68 , FGL2 as well as Fibrinogendeposits was detected by immunohistochemistry.18

BTLA的表達(dá)，15例慢性乙型肝炎患者肝臟中有2例檢測出BTLA表達(dá)，其余沒有檢測到BTLA的表達(dá)，然而在HBV-ACLF患者中，3例肝組織均檢測到大量BTLA的表達(dá)，圖1-2。圖 1-2：免疫組化分析肝組織中 BTLA 表達(dá)。HBV-ACLF 肝組織中 BTLA 大量表達(dá)，而只有 2 例（共 15 例）慢乙肝患者肝組織中檢測出 BTLA，正常人肝組織中未檢出。Fig1-2：Immunohistochemistry showed that the expression of BTLA (A) was absence in normal healthliver tissues. (B) Very rare BTLA+cells were observed in mild CHB. (C) The expression of BTLA oninflammatory cell-like cells, (D) macrophage-like cells,(E) and benign bile ducts were observed in livertissues of HBV-ACLP. (F) Mouse IgG1 isotype control.三、 BTLA主要表達(dá)于CD68+細(xì)胞為更進(jìn)一步明確BTLA的表達(dá)特征，我們通過免疫雙熒光染色分子BTLA與CD68、CD3、FGL2、CD31、CK18的共聚。結(jié)果如圖1-3所示，BTLA主要表達(dá)于肝組織中CD68+巨噬細(xì)胞、CK18的上皮細(xì)胞上，與FGL2共表達(dá)，而在CD3T細(xì)胞及CD31內(nèi)皮細(xì)胞幾乎無表達(dá)。19

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐逢敏;孫志紅;鄒春毅;;聯(lián)合應(yīng)用人工肝支持系統(tǒng)治療暴發(fā)性肝炎3例報告[J];透析與人工器官;2005年04期

2 姚集魯;;異煙肼與利福平并用所致的暴發(fā)性肝炎[J];國外醫(yī)學(xué).內(nèi)科學(xué)分冊;1977年Z2期

3 ;肝炎[J];國外科技資料目錄(醫(yī)藥衛(wèi)生);1998年03期

4 陳子長;;甲型、乙型和非甲非乙型暴發(fā)性肝炎的臨床與預(yù)后的差異[J];國外醫(yī)學(xué).內(nèi)科學(xué)分冊;1984年10期

5 董時軍;;單純皰疹病毒(HSV)可致暴發(fā)性肝炎[J];傳染病信息;1997年03期

6 劉華;草魚膽致急性腎功衰并暴發(fā)性肝炎一例[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;1999年03期

7 劉靜冰;劉秀峰;錢軍;秦叔逵;;美羅華聯(lián)合化療治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤致右下肢癱瘓及暴發(fā)性肝炎1例[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2008年10期

8 李高鈺;;HBsAg生成過剩對暴發(fā)性乙型病毒性肝炎的致病機(jī)理[J];醫(yī)衛(wèi)通訊;1978年02期

9 李元齋;王積仁;;3例暴發(fā)性肝炎的微循環(huán)障礙及其治療[J];上海醫(yī)學(xué);1981年02期

10 周明豐;;綜合征簡介[J];中國社區(qū)醫(yī)師;1986年12期

相關(guān)會議論文 前10條

1 宋桂芹;吳衛(wèi)平;宋春杰;尹嶺;朱克;;實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型的基因芯片研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

2 曹華;鄭捷;;UVA1照射硬皮病小鼠模型的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

3 陸樹良;金曙雯;金再敏;史濟(jì)湘;丁長囡;;燙傷小鼠模型制作中脫毛劑對皮膚組織損害的病理學(xué)觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會第六屆全國燒傷外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

4 陳欣;龔秀麗;曾凡一;黃淑幀;;遺傳病宮內(nèi)治療的研究-應(yīng)用改良的干細(xì)胞宮內(nèi)移植方法建立高嵌合率小鼠模型[A];中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

5 文峻;劉魯偉;范云;屈學(xué)民;龍開平;王斯剛;;一種心肌細(xì)胞替換實驗技術(shù)的研究[A];全國第九屆心臟學(xué)會第十二屆心功能學(xué)會《心臟雜志》編委會聯(lián)合學(xué)術(shù)會議論文集[C];2005年

6 羅萍;盧雪紅;吳曼;劉樹軍;尚秀蘭;;來氟米特對狼瘡腎炎小鼠的治療作用及機(jī)制探討[A];全國第八屆中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

7 杜家忠;李松濱;李寶龍;高維濱;;針刺對乳腺增生癥小鼠模型抑制作用的病理形態(tài)定量研究[A];中國實驗動物學(xué)會第五屆學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2000年

8 白麗;張宇紅;潘靜;王剛;丁健青;陳生弟;;紅景天甙對帕金森病小鼠模型的治療作用及其機(jī)制研究[A];第十一屆全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

9 鞠梅;張青松;張小華;陳昆;常寶珠;顧恒;;不同劑量的UVA1輻射硬皮病鼠模型的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第14次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

10 李文娟;范小芳;陳兆琴;胡良岡;陳然;鄧蔚;龔永生;;間斷低氧模擬睡眠呼吸暫停綜合征小鼠模型的建立[A];中國睡眠研究會第六屆學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 劉霞;美制造出感染丙肝病毒的小鼠模型[N];科技日報;2011年

2 郭宏德;暴發(fā)性肝炎 命名存在問題[N];中國保險報;2004年

3 孔琪　張連峰;小動物 大作為[N];健康報;2010年

4 記者 仇逸;紅斑狼瘡小鼠模型探病因[N];新華每日電訊;2003年

5 王迪;胰腺癌小鼠模型面世[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2003年

6 匡遠(yuǎn)深;小鼠模型助帕金森病早診早治[N];健康報;2008年

7 任荃;國內(nèi)首家“小鼠醫(yī)院”在滬建成[N];文匯報;2008年

8 本報記者 鄒曦;北京百萬實驗動物大遷徙[N];北京科技報;2007年

9 本報記者　 劉云濤;高TG血癥小鼠模型特殊表型值得深入研究[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 李雷;美構(gòu)建出成神經(jīng)管細(xì)胞瘤小鼠模型[N];中國醫(yī)藥報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 林寧;人參皂甙Rb1對高脂飲食誘導(dǎo)C57/BL6小鼠肥胖的預(yù)防作用及機(jī)制探討[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

2 趙剛;細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達(dá)對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的APOE缺陷小鼠腹主動脈瘤形成的影響及機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2011年

3 王玨;具有“人源性微環(huán)境”的乳腺癌原位和轉(zhuǎn)移小鼠模型的建立和研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

4 楊承英;BTLA在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎中的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

5 盧潔;人MDS荷瘤小鼠模型的建立及砷劑、沙利度胺在荷瘤小鼠體內(nèi)抗瘤作用與機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2005年

6 彭娟;白介素23調(diào)節(jié)過敏性氣道炎癥的機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2010年

7 劉海娜;巨噬細(xì)胞衍生趨化因子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

8 馬芹穎;快速老化小鼠SAMP8老化過程中自噬的改變以及mTOR信號通路功能研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

9 段敏超;CD_4~+白細(xì)胞介素-17~+輔助性T細(xì)胞在香煙暴露肺氣腫小鼠中的作用機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

10 喻晶;IFN-γ對小鼠破骨細(xì)胞前體CXCR4表達(dá)的調(diào)節(jié)及意義[D];華中科技大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李兆圣;亞甲藍(lán)對APP/PS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

2 林都;雙花顆粒對小鼠實驗性肝損傷的保護(hù)作用[D];西南大學(xué);2010年

3 王玲;表沒食子兒茶素沒食子酸酯對急性酒精中毒小鼠乙醇吸收的影響及其可能機(jī)制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

4 儲昭新;植物乳桿菌對IL-10基因敲除結(jié)腸炎小鼠黏附分子的影響[D];蘇州大學(xué);2010年

5 侯娟;Th17/Treg失衡在EAE小鼠模型免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中的作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

6 張靜;小鼠酒精性脂肪肝中線粒體生物合成的損傷[D];鄭州大學(xué);2010年

7 胡小丹;"Ala"~（16）-aFGF（1-29）對小鼠慢傳輸型便秘的治療作用研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

8 謝春鳳;羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植在抗衰老中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

9 劉鵬飛;促紅細(xì)胞生成素受體抗體抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 龐麗;9.4T~1H-MRS定量檢測阿爾茨海默病小鼠海馬不同代謝物濃度的研究[D];汕頭大學(xué);2010年

本文編號：2737742