【摘要】：目的： 通過建立肝硬化的動(dòng)物模型,并制備人臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells MSCs),研究臍血MSCs移植對(duì)肝硬化大鼠的治療作用,探討移植的臍血MSCs能否在肝硬化大鼠的肝內(nèi)定植、分化,表達(dá)人肝細(xì)胞標(biāo)志物基因。 方法： 1.復(fù)合因素法(40%CCL4油劑皮下注射+20%酒精飲用水+高脂飲食)誘導(dǎo)大鼠的肝硬化模型,HE及Masson染色檢測(cè)建模是否成功。 2.無菌條件下采集新生兒臍帶血,密度梯度離心法分離獲得人臍血單個(gè)核細(xì)胞,通過培養(yǎng)、純化、傳代擴(kuò)增得到臍血MSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞表面抗原(CD29、CD105、CD34、CD45),5-溴-2-脫氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine Brdu)在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,免疫熒光法檢測(cè)標(biāo)記是否成功。 3.將建模成功的肝硬化大鼠隨機(jī)分為：A組,門靜脈移植實(shí)驗(yàn)組(n=20)：經(jīng)門靜脈移植臍血MSCs1ml;B組,門靜脈移植對(duì)照組(n=20)：經(jīng)門靜脈注射等體積的PBS。正常大鼠也隨機(jī)分為2組：C組,門靜脈移植正常組(n=10)：經(jīng)門靜脈移植臍血MSCs1ml；D組,正常對(duì)照組(n=10)：普食普水喂養(yǎng)。移植四周后處死各組大鼠,下腔靜脈采血進(jìn)行肝功能及免疫相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)；HE及Masson染色了解各組大鼠臍血MSCs移植后的組織病理改變；免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫熒光法檢測(cè)經(jīng)Brdu標(biāo)記的臍血MSCs的定植情況；RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝硬化大鼠的肝組織是否有人源性肝細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)。 結(jié)果： 1.復(fù)合因素法建模8周可成功誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型,HE染色示：大鼠的正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,被假小葉所取代,假小葉內(nèi)肝細(xì)胞有不同程度變性和壞死,可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson染色：模型組大鼠可見清晰典型假小葉結(jié)構(gòu),膠原纖維呈藍(lán)色。 2.成功分離培養(yǎng)出人臍血MSCs,可見P3代細(xì)胞形態(tài)呈相對(duì)均一的長(zhǎng)梭行,平行排列或旋渦狀生長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示其細(xì)胞表型CD29、CD105表達(dá)率高,分別為93.37%、89.08%。免疫熒光檢測(cè)示,Brdu在體外可成功標(biāo)記臍血MSCs。 3.臍血MSCs經(jīng)門靜脈移植4周后,A組大鼠的一般情況好轉(zhuǎn),體重較移植前及B組相比明顯上升(P0.05)；肝功能與B組相比,ALT、AST、TBIL、ALB均有明顯改善(P0.05)。病理結(jié)果示：A組與B組相比,肝細(xì)胞壞死、脂肪變以及肝纖維化等病變程度均有改善,經(jīng)半定量分級(jí)評(píng)分顯示差異有顯著性(P0.05)。 4.臍血MSCs移植四周后,取A組大鼠肝組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查,可見經(jīng)Brdu標(biāo)記的陽性細(xì)胞,細(xì)胞核呈棕黃色在肝內(nèi)定植；免疫熒光檢測(cè)見Brdu標(biāo)記的陽性細(xì)胞,細(xì)胞核發(fā)紅色熒光在肝內(nèi)定植；RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A組大鼠肝組織有人源性CK18mRNA、ALB mRNA的表達(dá)。 5.臍血MSCs移植4周后,C組與D組相比,大鼠體重變化無顯著差異(P0.05)；ALT、AST、TBIL、ALB各指標(biāo)均無顯著差異(P0.05)；免疫相關(guān)指標(biāo)IgA、IgG、IgM、C3、C4變化均無顯著差異(P0.05)；C組大鼠肝組織、脾臟組織、肺組織、腎組織均有少量Brdu標(biāo)記的陽性細(xì)胞定植,但各器官病理檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)瘤樣生長(zhǎng),無病理改變。 結(jié)論： 1.人臍血MSCs移植能在一定程度上改善肝硬化大鼠的肝功能及肝臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。 2.經(jīng)門靜脈移植的人臍血MSCs可在肝硬化大鼠肝內(nèi)歸巢定植并向肝樣細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：2737596