【摘要】： [目的] 戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的經(jīng)消化道傳播的急性自限性疾病,以往通常發(fā)生于衛(wèi)生條件落后的發(fā)展中國(guó)家和落后國(guó)家,我國(guó)是高發(fā)地區(qū)之一。但是,近年來(lái)在一些發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)、歐洲等地陸續(xù)報(bào)道了非輸入性戊型肝炎的發(fā)生,另外,有證據(jù)顯示戊型肝炎還可以引起人畜共患性疾病,而且在孕婦死亡率可高達(dá)20-30%,對(duì)社會(huì)造成了極大的危害,因此戊型肝炎越來(lái)越受到人們的重視。迄今為止,尚無(wú)有效的HEV感染的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型,因此其感染和發(fā)病機(jī)制尚不清楚,而且也沒有建立統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和廣泛認(rèn)可的診斷試劑。本課題旨在通過臨床大樣本戊型肝炎病例的研究,建立戊型肝炎死亡的預(yù)報(bào)模型和新的診斷方法,并未后續(xù)研究提供臨床依據(jù)和線索。 [方法] 1.收集2007-2008年湖北武漢同濟(jì)醫(yī)院和傳染病院戊型肝炎患者共計(jì)210例,所有患者均采集系列血清進(jìn)行HEV RNA、血清學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)的檢測(cè),隨訪半年。將存活組與死亡組進(jìn)行組間比較,對(duì)有意義的指標(biāo)進(jìn)行單因素和多因素Logistic回歸分析,篩選出戊型肝炎患者死亡的危險(xiǎn)因素,建立戊型肝炎患者死亡概率的預(yù)報(bào)模型,并進(jìn)行評(píng)估。 2.利用來(lái)源于基因Ⅰ型戊型肝炎病毒開放讀碼框2,并可形成多聚體形式的p239抗原,建立抗HEV-IgA檢測(cè)的間接酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒。利用ROC曲線法確定臨界值。然后以2210份臨床排除急性戊型肝炎病毒感染血清作為陰性血清盤,245位臨床診斷戊型肝炎患者系列血清作為陽(yáng)性血清盤,評(píng)估試劑盒的特異度、靈敏度和臨床應(yīng)用價(jià)值。 3.構(gòu)建基因Ⅰ型和Ⅳ型戊型肝炎病毒完整的開放讀碼框3的真核表達(dá)質(zhì)粒,激光共聚焦顯微鏡觀察ORF3的細(xì)胞內(nèi)定位。MTT法檢測(cè)其對(duì)兩個(gè)基因型的戊型肝炎病毒ORF3基因?qū)epG2細(xì)胞增殖的影響,對(duì)抗放線菌素D損傷細(xì)胞的作用,western blotting檢測(cè)其對(duì)HepG2細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)的影響。 [結(jié)果] 1.湖北地區(qū)散發(fā)性戊型肝炎均為基因Ⅳ型戊型肝炎病毒感染,總病死率為10%(21／210)。男性多發(fā)(85.2%),中老年多見：全年均可見到發(fā)病,但是以第一季度為高發(fā)季節(jié),占到了全年總發(fā)病數(shù)的50.5%。血清總膽紅素(OR值=1.0009,每1μmol/L)、血尿素氮(OR值=1.178,每1mmol/L)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(OR值=9.216,每1)為戊型肝炎患者死亡的主要危險(xiǎn)因素。建立了戊型肝炎患者死亡概率的預(yù)報(bào)模型,從起病第二周即能較好的預(yù)測(cè)患者的臨床轉(zhuǎn)歸,曲線下面積達(dá)0.957。 2.利用P239抗原成功構(gòu)建了檢測(cè)抗HEV-IgA的間接ELISA試劑盒,特異度達(dá)到了99.6%(95%置信區(qū)間：99.2%-99.8%)。在245例臨床診斷戊型肝炎的患者,有84例患者血清中檢出HEV RNA。在此84例HEV RNA作為金標(biāo)準(zhǔn)的患者中,抗HEV-IgA、抗HEV-IgM和抗HEV-IgG的陽(yáng)性率分別為96.3%(81／84)(95%置信區(qū)間：89.8%～98.8%)、97.6%(82／84)(95%置信區(qū)間：91.7%～99.3%)和88.1%(74／84)(95%置信區(qū)間：79.5%～93.4%),并且沒有樣本抗HEV-IgA和抗HEV-IgM同時(shí)陰性的。在245例戊型肝炎患者中,發(fā)現(xiàn)9份分別來(lái)自于9例患者的血清樣本在急性期內(nèi)存在抗HEV-IgM陰性的時(shí)期,但是9份樣本抗HEV-IgA均為陽(yáng)性,其中兩例檢出HEV RNA。 3.成功構(gòu)建了基因Ⅰ型和Ⅳ型HEV ORF3的真核表達(dá)質(zhì)粒,測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功,并能夠在轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞成功表達(dá)。激光共聚焦顯示HEV ORF3蛋白主要定位與細(xì)胞漿內(nèi)而不能進(jìn)入細(xì)胞核。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因Ⅰ型和Ⅳ型HEV ORF3基因在正常情況下對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖沒有影響,而在放線菌素D處理的HepG2細(xì)胞中則能夠表現(xiàn)出顯著促進(jìn)存活的作用,且在兩個(gè)基因型HEV ORF3之間沒有顯著性差異。Western blotting顯示HEV ORF3能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞核內(nèi)P65的表達(dá),且在兩個(gè)基因型HEV ORF3之間沒有顯著性差異。 【結(jié)論】 1.武漢地區(qū)戊型肝炎僅見基因Ⅳ型HEV感染,HE患者中男性比例高于女性,中老年人為主,第一季度即冬春季為散發(fā)性戊型肝炎的高發(fā)季節(jié)。血清總膽紅素、血尿素氮和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值是戊型肝炎患者死亡的主要危險(xiǎn)因素,初步構(gòu)建了戊型肝炎患者死亡概率的預(yù)報(bào)模型,預(yù)測(cè)價(jià)值較好。 2.成功構(gòu)建抗HEV-IgA間接ELISA檢測(cè)試劑盒,其特異度和在基因Ⅳ型HEV感染患者中的靈敏度均較好,聯(lián)合抗HEV-IgM檢測(cè)可使戊型肝炎患者診斷的特異度和靈敏度均達(dá)到100%,有助于提高臨床上對(duì)戊型肝炎診斷的準(zhǔn)確度。 3.基因Ⅰ型和Ⅳ型HEV ORF3均定位于細(xì)胞胞漿中,對(duì)于放線菌素D處理的HepG2細(xì)胞具有保護(hù)作用,并有可能是通過激活NFκB通路而產(chǎn)生作用的。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.6
【圖文】：

圖2.HEVRNA陽(yáng)性樣本電泳圖(ORFZ:6298一6486nt)(2%凝膠)人C人GAATTG人TTTCGTCGGCT‘GTGGC人GCTGTTT曰卜人111

600匕p500匕p400bp300bp200bp 100匕pMarke「sgbp圖 2.HEVRNA陽(yáng)性樣本電泳圖(ORFZ:6298一6486nt)(2%凝膠)G人C人 GAATTG人 TTTCGTCGGCT‘ GTGGC人 GCTGTTTTTT

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本文編號(hào)：2736028