【摘要】： 目的：乙型肝炎病毒復發(fā)感染是影響肝移植受者的長期生存的重要因素之一。大劑量運用乙肝免疫球蛋白(HBIG)是預防HBV復發(fā)較有效的方法，但是其實際臨床應用受到多種因素限制。全人源化基因工程抗體片段：anti-HBs-Fab由乙肝表面抗體(HBsAb)重鏈Fd段和完整的輕鏈組成，是完整抗體的1/3，僅有一個抗原結(jié)合位點。它屬于小分子抗體，具有許多血源性抗體無法比擬的優(yōu)點。本研究擬構(gòu)建、生產(chǎn)和純化攜帶全人源化anti-HBs-Fab基因的1型重組腺相關(guān)病毒rAAV1-HBs-Fab；建立該基因工程小分子抗體的體內(nèi)外真核表達體系并檢測其體外預防HBV感染的功能。 方法：以一株來源于人源性噬菌體抗體庫的HBsAg高親和力Fab抗體基因的噬粒p3HB為模板，分別擴增出重鏈Fd和κ鏈基因；采用重疊PCR的方法分別在κ輕鏈和Fd重鏈基因的5’端接上人工合成的人κ鏈的前導編碼序列，構(gòu)建于真核表達載體plRES中IRES基因前后的兩個多克隆位點。雙酶切pIRES-Fab獲得Fd-IRES-κ片段，克隆入腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒pXXUF1中，命名為pXXUF1-HBs-Fab，酶切、PCR及測序鑒定。磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染PXX6，PXX12和pXXUF1-HBs-Fab三種質(zhì)粒進入293細胞，包裝具有感染力的1型重組腺相關(guān)病毒載體rAAV1-HBs-Fab。經(jīng)過48小時培養(yǎng)后ELISA鑒定上清中anti-HBs-Fab的表達；收集293細胞反復凍融3次后，CsCl_2密度梯度離心收集純化病毒。Dot-Blot測定病毒滴度。pXXUF1-HBs-Fab分別通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染HEK 293細胞及尾靜脈液壓法轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠。RT-PCR、ELISA、Western Blot和免疫組化等方法從基因和蛋白水平分析基因工程小分子抗體anti-HBs-Fab在體內(nèi)外真核細胞中的表達。應用羊抗人Fab抗體通過免疫親和層析法純化轉(zhuǎn)染細胞上清的anti-HBs-Fab，SDS-PAGE鑒定后用于以下功能檢測：與HBsAg混合孵育后加入HepG2細胞培養(yǎng)液中，間接免疫熒光技術(shù)檢測細胞表面黏附HBsAg的情況；加入Hep3B細胞培養(yǎng)液，檢測其在抗人Fab抗體輔助作用下介導補體對細胞的殺傷功能，計算細胞死亡率；與人HBV感染血清混合后加入人原代肝細胞培養(yǎng)液中，PCR、ELISA及免疫組化等技術(shù)檢測HBV感染人原代肝細胞的情況。 結(jié)果：測序分析表明pXXUF1-HBs-Fab中人κ鏈的前導肽、IRES、Vκ及V_H的序列正確，經(jīng)酶切及PCR鑒定證實Fd-IRES-κ基因片段正確插入pXXUF1。包裝293細胞培養(yǎng)上清檢測到anti-HBs-Fab的表達。1型重組腺相關(guān)病毒rAAV1-HBs-Fab純化后，病毒滴度達到1×10~(11)pfu/ml。pXXUF1-HBs-Fab轉(zhuǎn)染293細胞，獲得穩(wěn)定表達anti-HBs-Fab的細胞系293-anti-HBs-Fab。RT-PCR檢測顯示建系細胞胞內(nèi)有Fd重鏈及κ輕鏈的mRNA；ELISA及Western Blot分析培養(yǎng)上清，證實基因工程小分子抗體anti-HBs-Fab的分泌性表達，最高表達量可達1396pg/ml并具有與HBsAg特異性結(jié)合的活性；免疫組化檢測證實該細胞系胞漿中有棕黃色陽性顆粒。pXXUF1-HBs-Fab體內(nèi)轉(zhuǎn)染模型ELISA結(jié)果顯示小鼠血清中含有513.6±10.5pg/ml的ami-HBs-Fab表達；免疫組化顯示實驗組小鼠肝臟細胞有棕黃色陽性顆粒，部分腎小球毛細血管腔內(nèi)壁和腎臟集合管壁可見附著的Fab蛋白，其他腎實質(zhì)細胞未見表達。從293-anti-HBs-Fab細胞系培養(yǎng)上清中純化了5.65mg/L的anti-HBs-Fab，免疫熒光和流式細胞檢測顯示該基因工程小分子抗體處理后的HBsAg，不能黏附于HepG2細胞表面；處理后的Hep3B細胞在抗人Fab抗體輔助下大量被補體殺傷，細胞死亡率達87.98％；PCR檢測顯示處理后的人原代肝細胞中無HBV cccDNA合成，且ELISA及免疫組化結(jié)果表明肝細胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中均無HBsAg合成表達。 結(jié)論：成功構(gòu)建攜帶全人源化anti-HBs-Fab基因的1型重組腺相關(guān)病毒rAAV1-HBs-Fab；基因工程小分子抗體anti-HBs-Fab可在體內(nèi)外轉(zhuǎn)染pXXUF1-HBs-Fab的真核細胞中分泌性表達，并能通過腎小球濾過代謝；anti-HBs-Fab在體外具有預防HBV感染肝細胞的能力。為進一步研究rAAV1-HBs-Fab在預防肝移植后乙肝復發(fā)中的作用奠定了基礎。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R512.62
【圖文】：

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濟醫(yī)學院唐翁博士30個循環(huán)，最后一個循環(huán)后，72oC延伸1omin。4oC保SKPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析并純化(方法T載體的構(gòu)建:SKPCR產(chǎn)物與T載體的連接:見圖6，連接體系如下:T4DNALigasebuffers林lEM一Tvectorl協(xié)l(約SOng)化的PeR產(chǎn)物3拼l(約0.15拼g)DNA連接酶1閃

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本文編號：2733837