【摘要】： 肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是各種不同致病因子引起慢性肝病進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑,是肝臟對(duì)各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復(fù)反應(yīng)。其主要病理改變是細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過(guò)度合成與異常沉積。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)是參與該過(guò)程的最重要細(xì)胞,它的激活導(dǎo)致自身增殖和膠原合成增加被認(rèn)為是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié),而肝纖維化恢復(fù)期HSC凋亡明顯增多。因此,抑制HSC活化、增殖或誘導(dǎo)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。 第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因,可負(fù)性調(diào)控腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,其缺失或表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 近年來(lái),對(duì)PTEN的研究已從腫瘤領(lǐng)域逐漸延伸至非腫瘤領(lǐng)域。研究表明,在特發(fā)性肺纖維化患者的肺組織中,成纖維細(xì)胞的PTEN表達(dá)及其磷酸酶活力都低于正常肺成纖維細(xì)胞;并且其過(guò)表達(dá)或激活可抑制體外肺成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡。在有關(guān)PTEN與心肌纖維化的研究中也顯示PTEN基因敲除的小鼠心臟與體重之比增加、心肌纖維化程度明顯、心肌收縮性降低。這提示PTEN的低表達(dá)或失活參與了特發(fā)性肺纖維化及心肌纖維化的發(fā)生。而在PTEN與某些肝臟疾病的研究中,有研究發(fā)現(xiàn)特異性肝細(xì)胞PTEN缺失不僅可引起肝細(xì)胞癌而且還導(dǎo)致與肝纖維化密切相關(guān)的非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生。但迄今為止,PTEN在肝纖維化中的表達(dá)及作用,特別是對(duì)HSC增殖及凋亡的影響仍不清楚。為此,本研究應(yīng)用膽總管結(jié)扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型,探討PTEN在肝纖維化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與在體HSC增殖、凋亡的關(guān)系;并進(jìn)一步將攜帶野生型PTEN基因及其突變體G129E基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化HSC,觀察過(guò)表達(dá)的PTEN對(duì)活化HSC增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響,同時(shí)探討PTEN調(diào)控活化HSC增殖、凋亡及細(xì)胞周期的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,旨在為深入揭示肝纖維化的病理生理機(jī)制,尋求有效預(yù)防和治療肝纖維的新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下四部分: 第一部分PTEN在大鼠纖維化肝組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與在體肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系 目的:研究大鼠肝纖維化過(guò)程中肝組織的PTEN動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與在體HSC增殖、凋亡的關(guān)系。 方法:膽總管結(jié)扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型,HE、Masson三色染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化,免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠肝組織中PTEN及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的分布;免疫熒光雙標(biāo)記共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)測(cè)定大鼠肝組織中活化HSC的PTEN表達(dá);末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記(TUNEL)及α-SMA免疫組織化學(xué)雙染檢測(cè)在體活化HSC的凋亡;Western blot和Real-time Q-PCR檢測(cè)大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達(dá)。 結(jié)果:①HE及Masson三色染色顯示,膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型成功建立,隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)肝纖維化程度逐漸加重。在造模不同時(shí)間均可見(jiàn)不同程度的肝細(xì)胞變性壞死而導(dǎo)致正常肝細(xì)胞逐漸減少。②α-SMA免疫組織化學(xué)染色顯示,正常大鼠肝組織中僅在血管壁平滑肌細(xì)胞有弱陽(yáng)性表達(dá);隨著肝纖維化的發(fā)展,大鼠肝組織中α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多,造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk不同時(shí)間大鼠肝組織α-SMA的陽(yáng)性光密度值(0.16±0.01,0.17±0.01,0.21±0.01,0.26±0.02)均顯著高于假手術(shù)組(0.07±0.01), P0.01;且各組之間均有明顯差異(P0.01)。③TUNEL及α-SMA免疫組織化學(xué)雙重染色顯示,正常大鼠肝組織幾乎看不見(jiàn)凋亡HSC,隨著肝纖維化程度加重、活化HSC增多,凋亡HSC也增多,活化HSC與凋亡HSC共存。造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk不同時(shí)間大鼠肝組織HSC凋亡指數(shù)分別為4.57%±0.41%、4.02%±0.48%、3.45%±0.37%、2.88%±0.50%,即隨著肝纖維化程度加重,活化HSC凋亡指數(shù)逐漸減少(P0.01)。④PTEN免疫組織化學(xué)染色顯示,正常大鼠肝組織中PTEN蛋白有廣泛表達(dá),主要表達(dá)于細(xì)胞漿,在胞核中也有表達(dá);隨著肝纖維化的進(jìn)展,大鼠肝組織中PTEN陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少,主要分布于匯管區(qū)、纖維間隔及增生的膽管周圍細(xì)胞,PTEN蛋白的亞細(xì)胞定位沒(méi)有明顯變化。造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk大鼠肝組織PTEN的陽(yáng)性光密度值(0.15±0.01,0.12±0.02,0.09±0.01,0.07±0.01)均顯著低于假手術(shù)組(0.21±0.02),P0.01;且各組之間均有明顯差異(P0.01)。⑤共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察PTEN和α-SMA免疫熒光雙標(biāo)記的大鼠肝組織切片,單通道掃描可見(jiàn)PTEN和α-SMA陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物分別呈綠色和紅色熒光斑點(diǎn)狀,將單通道掃描的圖象混合后,在肝組織切片內(nèi)除了綠色和紅色熒光斑點(diǎn)外,還可見(jiàn)黃色熒光斑點(diǎn),因?yàn)槔w維化肝組織中只有活化HSC和少許血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)α-SMA,故這些黃色斑點(diǎn)絕大部分可看做是PTEN和α-SMA在HSC的共表達(dá)產(chǎn)物,也就是活化HSC的PTEN陽(yáng)性表達(dá)。共表達(dá)產(chǎn)物主要存在于活化HSC細(xì)胞漿,在部分細(xì)胞核中也有少許表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示,造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk大鼠肝組織中PTEN和α-SMA共存的HSC(PTEN表達(dá)陽(yáng)性的活化HSC)占α-SMA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(總的活化HSC)的比例分別為79.97%±5.49%、73.83%±5.04%、66.68%±4.58%、60.20%±4.65%。即隨著肝纖維化的進(jìn)展,表達(dá)PTEN的活化HSC比例逐漸減少(P0.01)。⑥Western blot顯示,造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk大鼠纖維化肝組織PTEN蛋白表達(dá)量(1.20±0.13,1.07±0.16, 0.88±0.08,0.73±0.07)均顯著低于假手術(shù)組(1.37±0.14),P0.01;且各組之間均有明顯差異(P0.01),即大鼠肝纖維化越重PTEN蛋白表達(dá)越低。⑦應(yīng)用Real-time Q-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠肝組織的PTEN mRNA表達(dá),并采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較PTEN mRNA在各組大鼠肝組織中的相對(duì)表達(dá)。以假手術(shù)組為對(duì)照組(其PTEN mRNA的表達(dá)量為1),則造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk大鼠纖維化肝組織中PTEN mRNA相對(duì)假手術(shù)組的表達(dá)倍數(shù)為0.66倍、0.53倍、0.44倍、0.37倍,均顯著低于假手術(shù)組,且隨著肝纖維化的發(fā)展逐漸下調(diào)(P0.01)。⑧Pearson’s相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),大鼠纖維化肝組織中PTEN表達(dá)與α-SMA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān),與PTEN陽(yáng)性的活化HSC比例呈顯著正相關(guān),與活化HSC凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān),r值分別為-0.92、0.78、0.76,P0.01。 結(jié)論:膽總管結(jié)扎法成功建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型;大鼠肝纖維化形成過(guò)程中HSC的活化、增殖逐漸加快,而活化HSC的凋亡指數(shù)卻逐漸減少;隨著肝纖維化進(jìn)展,大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達(dá)逐漸下調(diào),在體HSC的PTEN表達(dá)亦降低,其動(dòng)態(tài)表達(dá)與在體HSC的活化、增殖呈顯著負(fù)相關(guān),而與活化HSC凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)。 第二部分PTEN對(duì)體外活化肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響 目的:探討過(guò)表達(dá)的野生型PTEN及其突變體G129E(喪失了脂質(zhì)磷酸酶活性僅保留蛋白磷酸酶活性)對(duì)體外活化的HSC增殖、凋亡的影響及可能的機(jī)制。 方法:利用AD293細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的腺病毒(Ad-PTEN、Ad-G129E、Ad-GFP),并測(cè)定滴度;以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化的HSC;Western blot及Real-time Q-PCR檢測(cè)HSC PTEN表達(dá);MTT法檢測(cè)HSC增殖;TUNEL及碘化丙啶(propidium iodide, PI)標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HSC凋亡;Western blot檢測(cè)HSC的凋亡調(diào)控基因Bcl-2及Bax表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組如下:①Control組,僅以含8%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染步驟入無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM代替病毒液;②Ad-GFP組,轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的空病毒Ad-GFP;③Ad-PTEN組,轉(zhuǎn)染攜帶野生型PTEN基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒Ad-PTEN;④Ad-G129E組,轉(zhuǎn)染攜帶PTEN的突變體G129E基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒Ad-G129E。 結(jié)果:①通過(guò)反復(fù)感染AD293細(xì)胞的方法使病毒擴(kuò)增獲得了實(shí)驗(yàn)所需的病毒液(Ad-PTEN、Ad-G129E、Ad-GFP的滴度分別為1.2 x 109、1.5 x 109、1.8 x 109 pfu/ml)。②腺病毒感染HSC后72 h,應(yīng)用Real time Q-PCR檢測(cè)活化HSC PTEN mRNA表達(dá),并采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較PTEN mRNA在各組HSC中的表達(dá)。以Control組為對(duì)照組(其PTEN mRNA表達(dá)量為1),則Ad-GFP組、Ad-PTEN組和Ad-G129E組相對(duì)Control組的PTEN mRNA表達(dá)倍數(shù)分別為0.993倍、1.569倍和1.561倍。很明顯,Ad-PTEN組及Ad-G129E組PTEN mRNA表達(dá)明顯高于Control組及Ad-GFP組(P0.01);而Ad-PTEN組與Ad-G129E組,以及Control組與Ad-GFP組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。進(jìn)一步應(yīng)用Western blot分析各組HSC的PTEN蛋白表達(dá),Ad-PTEN組(1.66±0.09)、Ad-G129E組(1.65±0.09)均顯著高于Control組(1.10±0.07)及Ad-GFP組(1.09±0.07),P0.01;而Control組與Ad-GFP組之間,以及Ad-PTEN組和Ad-G129E組之間均無(wú)明顯差異(P0.05)。證明野生型PTEN基因及其突變體G129E基因成功轉(zhuǎn)染入體外活化的HSC。③MTT檢測(cè)顯示,野生型PTEN基因及G129E基因轉(zhuǎn)染活化HSC后24 h對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明抑制(P0.05)。但在48 h、72 h HSC增殖受到明顯抑制,Ad-PTEN組增殖抑制率為14.03%、23.12%,而Ad-G129E組增殖抑制率是9.52%、12.63%(均以Control組為對(duì)照)。在各時(shí)間點(diǎn),Ad-GFP組與Control組A值比較無(wú)明顯差異(P0.05)。顯然,野生型PTEN對(duì)HSC增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于G129E。④TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在腺病毒感染HSC后72 h,Ad-PTEN組HSC凋亡率增至29.81%±2.52%,Ad-G129E組增至26.37%±1.97%均顯著高于Control組(1.98%±0.25%)及Ad-GFP組(2.16%±0.28%),P0.01;而Ad-PTEN組HSC凋亡率亦明顯高于Ad-G129E組(P0.01);Ad-GFP組與Control組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。⑤PI標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,Ad-PTEN組HSC凋亡率(20.84%±1.44%)、Ad-G129E組HSC凋亡率(17.54%±1.76%)均顯著高于Control組(1.12%±0.57%)及Ad-GFP組(1.21%±0.22%) , P0.01 ;而Ad-PTEN組亦明顯高于Ad-G129E組(P0.01);但Ad-GFP組與Control組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。⑥Western blot檢測(cè)腺病毒感染HSC后72 h,各組HSC Bcl-2蛋白表達(dá),Ad-PTEN組(1.16±0.03)、Ad-G129E組(1.24±0.05)均顯著低于Control組(1.37±0.06)及Ad-GFP組(1.34±0.08),P0.01,并且Ad-PTEN組較Ad-G129E組也明顯降低(P0.05),但Control組與Ad-GFP組之間無(wú)明顯差異(P0.05);而各組HSC Bax蛋白表達(dá),Ad-PTEN組(1.50±0.05)、Ad-G129E組(1.41±0.05)均較Control組(1.28±0.06)及Ad-GFP組(1.26±0.08)顯著增高,P0.01,同時(shí)Ad-PTEN組明顯高于Ad-G129E組(P0.05),Control組與Ad-GFP組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。 結(jié)論:外源性野生型PTEN基因及G129E基因成功轉(zhuǎn)染體外活化HSC;其過(guò)表達(dá)可明顯抑制活化HSC增殖,誘導(dǎo)活化HSC凋亡,并引起HSC的凋亡調(diào)控基因Bax表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)下降。而且野生型PTEN的作用明顯強(qiáng)于G129E。 第三部分PTEN對(duì)體外活化肝星狀細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)控作用 目的:探討過(guò)表達(dá)的野生型PTEN及其突變體G129E對(duì)體外活化HSC細(xì)胞周期的調(diào)控作用。 方法:體外培養(yǎng)活化的HSC,以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外活化的HSC;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HSC細(xì)胞周期時(shí)相;Western blot及Real-time Q-PCR檢測(cè)HSC的PTEN、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、細(xì)胞周期素依賴性激酶4(Cyclin dependent kinase4, CDK4)及細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor, CDI)之一的P27kip1蛋白及mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組同第二部分。 結(jié)果:①Real-time Q-PCR及Western blot檢測(cè)證實(shí)外源性野生型PTEN基因及其突變體G129E基因在體外活化HSC大量表達(dá)(結(jié)果同第二部分)。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,G0/G1期HSC細(xì)胞數(shù),Ad-PTEN組(67.68%±2.75%)、Ad-G129E組(61.17%±3.41%)均較Control組(53.01%±2.37%)及Ad-GFP組(53.85%±3.08%)明顯增高(P0.01) ,而Ad-PTEN組也明顯高于Ad-G129E組(P0.01);S期HSC細(xì)胞數(shù),Ad-PTEN組(14.42%±1.81%)、Ad-G129E組(18.17%±2.43%)均較Control組(22.17%±1.99%)及Ad-GFP組(21.54%±1.74%)明顯降低(P0.01) ,而Ad-PTEN組亦明顯低于Ad-G129E組(P0.01);G2/M期HSC細(xì)胞數(shù):Ad-PTEN組(17.90%±2.70%)、Ad-G129E組(20.66%±2.37%)均明顯低于Control組(24.82%±3.81%)及Ad-GFP組(24.62%±3.15%),P0.01、P0.05,而Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,各期Control組與Ad-GFP組之間HSC細(xì)胞數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。③腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各組HSC cyclinD1蛋白表達(dá),Ad-PTEN組(1.12±0.07)、Ad-G129E組(1.23±0.05)均較Control組(1.45±0.05)及Ad-GFP組(1.47±0.08)顯著降低(P0.01),Ad-PTEN組亦明顯低于Ad-G129E組(P0.01),而Control組與Ad-GFP組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。進(jìn)一步應(yīng)用Real time Q-PCR檢測(cè)各組HSC cyclinD1 mRNA表達(dá),并應(yīng)用相對(duì)定量2-△△Ct法比較cyclinD1 mRNA在各組HSC中的相對(duì)表達(dá)。以Control組為對(duì)照組(其cyclinD1 mRNA表達(dá)量為1),則Ad-GFP組、Ad-PTEN組及Ad-G129E組相對(duì)Control組的cyclinD1 mRNA表達(dá)倍數(shù)分別為1.011倍、0.773倍和0.838倍。顯然,Ad-PTEN組及Ad-G129E組CyclinD1 mRNA表達(dá)明顯低于Control組及Ad-GFP組(P0.01),Ad-PTEN組較Ad-G129E組也顯著降低,而Control組與Ad-GFP組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。④腺病毒感染HSC后72 h,Western blot檢測(cè)各組HSC CDK4蛋白表達(dá),Ad-PTEN組(1.05±0.07)、Ad-G129E組(1.18±0.06)均較Control組(1.41±0.03)及Ad-GFP組(1.43±0.06)顯著降低(P0.01),而Ad-PTEN組亦明顯低于Ad-G129E組(P0.01),但Control組與Ad-GFP組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。進(jìn)一步應(yīng)用Real time Q-PCR檢測(cè)各組HSC的CDK4 mRNA表達(dá),并應(yīng)用相對(duì)定量2-△△Ct法比較CDK4 mRNA在各組HSC中的相對(duì)表達(dá)。以Control組為對(duì)照組(其CDK4 mRNA表達(dá)量為1),則Ad-GFP組、Ad-PTEN組及Ad-G129E組相對(duì)Control組的CDK4 mRNA表達(dá)倍數(shù)為1.007倍、0.738倍和0.822倍。顯然,Ad-PTEN組、Ad-G129E組CDK4 mRNA表達(dá)較Control組及Ad-GFP組明顯降低(P0.01),Ad-PTEN組也顯著低于Ad-G129E組(P0.01),但Control組與Ad-GFP組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。⑤腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各組HSC P27kip1蛋白表達(dá),Ad-PTEN組(1.40±0.03)、Ad-G129E組(1.28±0.08)均顯著高于Control組(1.11±0.04)及Ad-GFP組(1.12±0.04),P0.01,Ad-PTEN組較Ad-G129E組亦明顯升高(P0.01),但Control組與Ad-GFP組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。進(jìn)一步應(yīng)用Real time Q-PCR檢測(cè)各組HSC P27kip1 mRNA表達(dá),并應(yīng)用相對(duì)定量2-△△Ct法比較P27kip1 mRNA在各組HSC中的表達(dá)。以Control組為對(duì)照組(其P27kip1 mRNA表達(dá)量為1),則Ad-GFP組、Ad-PTEN組和Ad-G129E組相對(duì)Control組的P27kip1 mRNA表達(dá)倍數(shù)為1.008倍、1.264倍和1.157倍�？梢钥闯�,Ad-PTEN組、Ad-G129E組P27kip1 mRNA表達(dá)明顯高于Control組及Ad-GFP組(P0.01),Ad-PTEN組也較Ad-G129E組顯著升高(P0.01),而Control組與Ad-GFP組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。 結(jié)論:過(guò)表達(dá)的野生型PTEN及G129E顯著抑制體外活化HSC細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化,阻滯HSC細(xì)胞周期時(shí)相于G0/G1期;同時(shí)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上下調(diào)活化HSC的cyclinD1、CDK4表達(dá),上調(diào)P27kip1表達(dá),這可能是其阻滯活化HSC細(xì)胞周期進(jìn)程的重要機(jī)制。并且,在上述作用中野生型PTEN明顯強(qiáng)于G129E。 第四部分PTEN調(diào)控活化肝星狀細(xì)胞行為的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 目的:探討PTEN調(diào)控活化肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法:體外培養(yǎng)活化HSC,以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外活化HSC;Western blot檢測(cè)HSC的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B, Akt)、p-Akt(Thr308)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激1(extracellular signal-regulated kinase1, ERK1)、p-ERK1蛋白表達(dá);Real-time Q-PCR檢測(cè)Akt、ERK1 mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組同第二部分。 結(jié)果:①Real-time Q-PCR及Western blot檢測(cè)證實(shí)外源性野生型PTEN基因及其突變體G129E基因在體外活化HSC大量表達(dá)(結(jié)果同第二部分)。②腺病毒感染HSC后72 h,Western blot及Real-time Q-PCR顯示野生型PTEN及G129E對(duì)HSC Akt蛋白及其mRNA表達(dá)均無(wú)明顯影響(P0.05);而Western blot顯示Ad-PTEN組p-Akt(Thr308)蛋白表達(dá)(0.63±0.04)顯著低于Ad-G129E組(0.93±0.03)、Control組(0.95±0.04)及Ad-GFP組(0.94±0.03),P0.01,但Ad-G129E組、Control組及Ad-GFP組之間p-Akt(Thr308)表達(dá)無(wú)顯著差別(P0.05)。③腺病毒感染HSC后72 h,Western blot及Real-time Q-PCR顯示野生型PTEN及G129E對(duì)HSC ERK1蛋白及mRNA表達(dá)均無(wú)明顯影響(P0.05);而Western blot顯示Ad-PTEN組p-ERK1蛋白表達(dá)(0.65±0.04)、Ad-G129E組p-ERK1蛋白表達(dá)(0.68±0.07)均顯著低于Control組(0.84±0.07)及Ad-GFP組(0.85±0.06),P0.01,但Ad-PTEN組與Ad-G129E組,以及Control組與Ad-GFP組之間p-ERK1表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05)。 結(jié)論:PTEN通過(guò)其磷酸酶活性抑制Akt及ERK1的磷酸化;其負(fù)性調(diào)控活化HSC細(xì)胞周期、抑制活化HSC增殖及誘導(dǎo)活化HSC凋亡的作用與PI3K/Akt、ERk1/2信號(hào)通路的活性抑制有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575.2

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 楊念;中藥復(fù)方T11治療慢性肝損傷的藥效學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2729609