【摘要】：目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是指由于長期飲酒或短期內(nèi)大量飲酒引起的肝損傷。其病因明確,但發(fā)病機制復雜多樣,尚未被完全闡明。我們團隊前期通過酒精灌胃法建立大鼠ALD模型,發(fā)現(xiàn)酒精刺激后引起沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin1,SIRT1)、精氨酸/絲氨酸剪接因子10(splicing factor,arginine/serine-rich 10,SFRS10)的m RNA及蛋白表達水平逐漸下降。SFRS10可以引起Lipin-1選擇性剪接,從而形成不同的異構(gòu)體。隨后我們在細胞水平,給予AML-12小鼠肝細胞梯度酒精刺激培養(yǎng),建立酒精性肝細胞模型,并降低SIRT1表達,發(fā)現(xiàn)SIRT1低表達導致SFRS10表達水平下降,總Lipin-1及Lipin-1β表達水平升高,而Lipin-1α表達水平則顯著降低。本研究選用能代謝酒精的AML-12小鼠肝細胞,應用SFRS10si RNA降低AML-12小鼠肝細胞內(nèi)SFRS10表達,應用油紅O染色法觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;在細胞水平闡釋降低SFRS10表達對SIRT1和Lipin-1表達水平的影響。方法:復蘇小鼠AML-12細胞給予含10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1‰HEPES、1%青-鏈霉素抗體的高糖DMEM培養(yǎng)基在5%CO2,37℃恒溫條件下培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期,降低SFRS10基因表達,分別設置空白對照組(Blank)、SFRS10si RNA陰性對照組(SFRS10si RNA NC)、SFRS10si RNA組、SFRS10si RNA+酒精組。陰性對照組及實驗組分別將SFRS10si RNA陰性無關對照序列、SFRS10si RNA轉(zhuǎn)染至AML-12細胞,空白對照組中加入等體積的脂質(zhì)體,培養(yǎng)4-6h后,更換為新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至18-24小時,SFRS10si RNA+酒精組中加入120m M濃度的酒精,其余三組加入相同體積的生理鹽水,繼續(xù)培養(yǎng)24h,收集細胞。分別應用RT-q PCR和Western blot法檢測SFRS10、SIRT1、Lipin-1、Lipin-1α、Lipin-1β的m RNA及蛋白表達水平;用4%多聚甲醛固定,給予行油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。結(jié)果:1降低小鼠AML-12細胞中SFRS10表達,通過RT-q PCR法檢測SIRT1、SFRS10、總Lipin-1、Lipin-1α及Lipin-1βm RNA的表達水平,正常AML-12細胞SIRT1、SFRS10、細胞核內(nèi)Lipin-1α表達水平相對較高,總Lipin-1及細胞質(zhì)內(nèi)Lipin-1β表達水平均較低;與空白對照組相比,SFRS10si RNA組SFRS10的表達顯著降低,SIRT1及總Lipin-1的表達水平無明顯變化(P均0.05);細胞質(zhì)中Lipin-1β表達水平明顯升高,而細胞核中Lipin-1α表達水平明顯降低(P均0.01);與SFRS10si RNA組比較,SFRS10si RNA+酒精組中,SFRS10、Lipin-1α表達水平進一步降低(P均0.01),SIRT1表達水平也出現(xiàn)明顯降低(P0.01),Lipin-1β表達水平進一步上升,總Lipin-1表達水平也出現(xiàn)明顯升高(P均0.01);與空白對照組相比SFRS10si RNA NC組內(nèi)各指標表達水平無明顯差異(P均0.05)。降低SFRS10基因表達后,與空白對照組相比,SFRS10si RNA NC組無明顯變化(P0.05),SFRS10si RNA組Lipin-1β/α的比值顯著升高(P0.01);而且SFRS10si RNA+酒精組,Lipin-1β/α的比值進一步增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。2降低SFRS10表達后,通過Western blot法檢測SIRT1、SFRS10、總Lipin-1、Lipin-1β及Lipin-1α的蛋白表達水平,我們發(fā)現(xiàn)與RT-q PCR法檢測結(jié)果一致:正常AML-12細胞中SIRT1、SFRS10和Lipin-1α蛋白表達水平較高,而Lipin-1及Lipin-1β表達水平較低;與空白對照組相比,SFRS10si RNA組中SFRS10的表達顯著降低,細胞質(zhì)中Lipin-1β表達水平明顯升高,細胞核中Lipin-1α表達水平明顯降低(P均0.01),而SIRT1及總Lipin-1的表達水平無明顯變化(P0.05);SFRS10si RNA+酒精組中,SFRS10、Lipin-1α表達水平進一步下降(P均0.01);SIRT1表達水平也出現(xiàn)明顯降低(P0.01);細胞質(zhì)中Lipin-1β表達水平進一步升高,總Lipin-1表達水平也出現(xiàn)明顯升高(P均0.01);與空白對照組相比,SFRS10si RNA陰性對照組中各個指標表達無明顯差異(P均0.05)。降低SFRS10表達后,與空白對照組相比,SFRS10si RNA NC組無明顯變化(P0.05),SFRS10si RNA組Lipin-1β/α的比值顯著升高(P0.01);SFRS10si RNA+酒精組,Lipin-1β/α的比值進一步增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。3通過油紅O染色法觀察小鼠AML-12細胞,比較各組間脂質(zhì)變化情況,我們發(fā)現(xiàn):正常對照組及陰性對照組中AML-12細胞內(nèi)未見明顯脂肪變性;通過基因工程技術(shù)降低SFRS10表達后,SFRS10si RNA組中AML-12細胞內(nèi)可見較多的紅色脂滴;而SFRS10si RNA+酒精組中AML-12細胞內(nèi)可見大量的紅色脂滴。結(jié)論:SFRS10表達降低對SIRT1無顯著影響,它可能作為上游因子通過調(diào)節(jié)Lipin-1的選擇性剪接,改變Lipin-1β/α比值引起肝細胞脂肪變性。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李園園;華艷芳;周俊英;;酒精性肝病發(fā)病機制[J];臨床薈萃;2016年07期

相關碩士學位論文 前1條

1 孫海華;敲除SIRT1基因?qū)π∈驛ML-12細胞中SFRS10、Lipin 1表達的影響[D];河北醫(yī)科大學;2016年

本文編號：2729047