【摘要】： 目的骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能[1],在機體組織損傷修復過程及細胞移植治療等多個領域有廣闊的應用前景。隨著BMSCs用于組織修復和基因治療的研究,體內以及體外培養(yǎng)擴增的BMSC的定向募集遷移潛能引起人們的關注。本實驗將分離、培養(yǎng)、擴增、熒光標記大鼠BMSCs,經(jīng)靜脈移植入潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)模型大鼠,擬探討移植細胞濃度、以及硝普鈉對BMSCs歸巢到結腸的影響。為BMSCs在消化管組織工程以及腸黏膜損傷性疾病治療研究中的應用,提供基礎理論和實驗依據(jù)。 第一部分骨髓間充質干細胞的生物學特性 1.取4-6w SD大鼠骨髓細胞,分離、培養(yǎng)、擴增獲取BMSCs。流式細胞儀檢測第3和第5代(P3和P5)BMSCs的免疫表型。結果:分離、培養(yǎng)原代細胞3～12d,細胞數(shù)量迅速增多,具有典型的長梭狀的形態(tài)及漩渦狀排列的特征。流式細胞儀分析P3和P5細胞表面標記物CD44、CD90為陽性,CD45為陰性。表達CD44、CD90的均一性分別為98.26±0.48%及98.68±0.32%。 2.取P3大鼠BMSCs用1μmoL/L的地塞米松、0.5 mmoL/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10 mg/L的胰島素、100mmoL/L的吲哚美辛(indomethncin)和10%FBS的H-DMEM誘導培養(yǎng)。誘導第3d起光鏡下可見細胞變?yōu)閳A形或橢圓形,胞質有脂滴。誘導第10d,油紅O染色脂滴呈橘紅色;對照組仍為長梭形,無脂滴出現(xiàn)。另用含地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、維生素C 50mg/L和10%FBS的L-DMEM的條件培養(yǎng)液定向誘導P3細胞向成骨細胞分化。從誘導第2d開始,部分細胞由長梭形逐漸變?yōu)榱⒎叫?進而轉變?yōu)槎嘟切?培養(yǎng)第8d時,大多數(shù)細胞轉變?yōu)槎嘟切?19d左右出現(xiàn)鈣化結節(jié),茜素紅染色呈橘紅色;對照組細胞仍為長梭形,未見鈣結節(jié)形成。 第二部分靜脈移植骨髓間充質干細胞在潰瘍性結腸炎大鼠結腸的分布 1. SD大鼠30只隨機分為A、B、C組,以免疫+TNBS/乙醇復合法建立UC模型。制備DAPI熒光標記的P3～P5-BMSCs懸液備用。模型制備完成后24 h內,3組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射1mL分別含1×106、5×106、1×107的DAPI標記的BMSCs。移植后第7、14 d各處死5只大鼠,取結腸做恒冷切片,熒光顯微鏡下計數(shù)各組DAPI標記BMSCs在潰瘍部位和正常部位的細胞數(shù)。相同切片再經(jīng)HE染色,觀察形態(tài)。結果:移植后第7、14 d,各組大鼠結腸均見藍色熒光標記的BMSCs,主要分布于黏膜層及黏膜下層,偶見于肌層及外膜。統(tǒng)計結果顯示:移植第7、14 d各組潰瘍部位陽性細胞數(shù)明顯高于正常部位陽性細胞數(shù)(F=65.17,P0.01);移植第7d,B組潰瘍及正常部位的細胞數(shù)均高于A組(F=13.06,P 0.05),B組與C組差異不顯著。 2. SD大鼠20只隨機分為D、E組,同樣方法建立UC模型。制備DAPI熒光標記的P3～P5 BMSCs懸液備用。模型制備完成后24 h內,2組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射1mL含5×106熒光標記的BMSCs懸液,E組同時加入含0.2mg/kg體重的硝普鈉。移植后第7、14 d每組各處死5只大鼠,取結腸觀察計數(shù)各組DAPI標記BMSCs在結腸潰瘍部位和正常部位的細胞數(shù)。相同切片再經(jīng)HE染色,觀察形態(tài)。結果:移植后第7、14 d,熒光標記的BMSCs在D、E組UC大鼠結腸的主要分布同A、B、C組。移植第7、14 d各組潰瘍部位陽性細胞數(shù)明顯高于正常部位陽性細胞數(shù)(F=354.54,P 0.01);移植第7 d,E組潰瘍處的細胞數(shù)均高于D組(F=15.00,P 0.05);第7d和14d,E組正常部位的細胞數(shù)均高于D組(F=23.12,P 0.05)。 全文結論 1.用貼壁篩選法,成功分離得到大鼠BMSCs,流式細胞儀分析培養(yǎng)的P3、P5-BMSCs具有MSCs的表面標記特征。 2.所獲P3-BMSCs在體外可誘導分化為成骨細胞或者脂肪細胞,證明所分離的BMSCs具有多向分化的能力。 3.移植第7、14 d,各組結腸潰瘍部位熒光標記的BMSCs細胞數(shù)明顯高于非病變部位,這提示病損的組織和器官對BMSCs可能有特異的趨化作用。 4. 3種劑量BMSCs經(jīng)靜脈移植入UC大鼠后在其結腸分布的統(tǒng)計結果顯示,并非移植細胞數(shù)量越多,遷移到結腸損傷部位的細胞就越多,最適移植細胞數(shù)量為5×106個。 5.單純移植BMSCs與聯(lián)合硝普鈉移植BMSCs比較,前者遷移到結腸的BMSCs數(shù)明顯低于后者。表明移植細胞同時給與硝普鈉能促進BMSCs向結腸的遷移。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R574.6

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