發(fā)布時間：2020-06-24 17:16

【摘要】：目的：構(gòu)建pEGFP-N1-AQP7、pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9重組質(zhì)粒,驗(yàn)證其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)情況,檢測其對L-02細(xì)胞AQP9表達(dá)的影響及其對L-02細(xì)胞脂肪變性的的作用,利用電穿孔的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入減毒沙門氏菌構(gòu)建重組SL7207疫苗株,為AQP7及AQP9在非酒精性脂肪肝病的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)從人脂肪組織及肝臟組織中提取總RNA,通過RT-PCR獲得AQP7及AQP9基因,將其克隆到pEGFP-N1質(zhì)粒上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,將其轉(zhuǎn)染COS-7真核表達(dá)細(xì)胞,通過觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)、]RT-PCR和Western blot檢測其在COS-7中的表達(dá)；(2)構(gòu)建針對人AQP9的干擾質(zhì)粒pshRNA-AQP9,將其轉(zhuǎn)染L-02肝細(xì)胞,通過RT-PCR和Western blot檢測其抑制效率；(3)將pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9分別轉(zhuǎn)染油酸誘導(dǎo)脂肪變性的L-02細(xì)胞,檢測其對L-02細(xì)胞脂肪變性的作用；(4)通過電穿孔的方法將pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌SL7207并檢驗(yàn)其表達(dá)情況和穩(wěn)定性。 結(jié)果：(1)通過RT-PCR獲得AQP7及AQP9基因片斷,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,驗(yàn)證了其在COS-7細(xì)胞中表達(dá)并與綠色熒光蛋白融合；(2)成功構(gòu)建pshRNA-AQP9,并篩選出對L-02細(xì)胞AQP9干擾效果明顯的重組質(zhì)粒；(3)成功建立L-02細(xì)胞脂肪變性模型,pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9對其脂肪變性程度分別有加重及減輕作用；(4)成功構(gòu)建重組SL7207疫苗株SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9。 結(jié)論：通過油酸誘導(dǎo)建立L-02肝細(xì)胞脂肪變性模型,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-AQP9上調(diào)其AQP9的表達(dá)可使其脂肪變性程度加重,反之,轉(zhuǎn)染pshRNA-AQP9下調(diào)其AQP9表達(dá)能使其脂肪變性程度減輕,表明AQP9在L-02細(xì)胞脂肪變性中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.5
【圖文】：

脂肪組織及肝臟組織總RNAI%瓊脂糖凝膠電泳

155脂肪組織總RNA肝臟組織總RNA圖1一1脂肪組織及肝臟組織總RNAI%瓊脂糖凝膠電泳Figurel一 1TOtalRNAI%agarosegelelcctrol)horesisofadil)osetissueandlivertissue2.2RT一PCR擴(kuò)增目的基因?qū)l，~pCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，在 1O29bp及在888bp附近有特異性條帶，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計相一致，提示擴(kuò)增產(chǎn)物為AQP7片段及AQPg片段，見圖卜2。231029飾673bP888卜P678卜P AQP7PCR產(chǎn)物圖1一ZAQP7及AQPgPCR產(chǎn)物 AQPgPCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳Figurcl一 2The20/0agarosegelelectroPhorcsisofAQP7andAQPgPCRI)roduetion DNAMa人er(DLZ()()());2.3:RT~pCR產(chǎn)物 DNAMaker(DL2000);2.3;Rl’ -PCRProductlon2

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本文編號：2728156